OCSE TG 439 Irritazione cutanea in vitro: metodo di test sull'epidermide umana ricostruita

Pubblicato nell'ambito delle linee guida OCSE sulla condotta aziendale responsabile per le imprese multinazionali (linee guida OCSE). Un test in vitro utilizzato per l'identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti (sostanze e miscele) in conformità con lo standard "OCSE TG 439 Irritazione cutanea in vitro: metodo di test dell'epidermide umana ricostruita", Sistema globale armonizzato di classificazione ed etichettatura (GHS) delle Nazioni Unite, categoria 2 viene spiegato il metodo

Questo metodo si basa sull'epidermide umana ricostruita (RhE), che nel suo design complessivo imita da vicino le proprietà biochimiche e fisiologiche delle parti superiori della pelle umana. La vitalità cellulare viene misurata mediante la conversione enzimatica del colorante vitale MTT nel sale blu di formazan, che viene misurato quantitativamente dopo l'estrazione dai tessuti. Le sostanze irritanti in esame sono definite dalla loro capacità di ridurre la vitalità cellulare al di sotto di livelli soglia definiti (pari al 2% o meno per la categoria 50). Le sostanze chimiche colorate possono anche essere testate utilizzando una procedura HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni).

Esistono tre metodi di prova convalidati conformi allo standard OCSE TG 439. A seconda del quadro normativo e del sistema di classificazione utilizzati, questa procedura può essere utilizzata per determinare l'irritazione cutanea delle sostanze in esame come test surrogato autonomo per i test di irritazione cutanea in vivo o come test surrogato parziale nell'ambito di una strategia di test su più livelli.

In linea di principio, la sostanza chimica in esame viene applicata localmente a un modello tridimensionale RhE (epidermide umana ricostruita) costituito da cheratinociti epidermici di derivazione umana coltivati ​​e non trasformati per creare un modello multistrato altamente differenziato dell'epidermide umana. È costituito da strati regolari basali, spinosi e granulari e da uno strato corneo multistrato contenente strati lipidici lamellari intercellulari che rappresentano le principali classi lipidiche simili a quelle trovate in vivo.

L'irritazione cutanea indotta da sostanze chimiche si manifesta principalmente con eritema ed edema ed è il risultato di una cascata di eventi che inizia quando le sostanze chimiche attraversano lo strato corneo e danneggiano gli strati inferiori dei cheratinociti e di altre cellule della pelle.

Le cellule danneggiate possono rilasciare mediatori dell’infiammazione o avviare una cascata infiammatoria che agisce anche sulle cellule del derma, in particolare sulle cellule stromali ed endoteliali dei vasi sanguigni. È l'espansione e l'aumento della permeabilità delle cellule endoteliali che produce l'eritema e l'edema osservati. In particolare, i metodi di analisi basati su RhE misurano gli eventi iniziali nella cascata, come il danno cellulare o tissutale, utilizzando la vitalità cellulare come lettura quando non c'è vascolarizzazione nel sistema di analisi in vitro.

Nel modello RhE, la vitalità cellulare viene misurata mediante la conversione enzimatica del colorante vitale MTT nel sale blu di formazano, che viene misurato quantitativamente dopo la rimozione dai tessuti (MTT viene utilizzato per valutare la vitalità cellulare in funzione del potenziale redox). Le sostanze chimiche irritanti sono definite dalla loro capacità di ridurre la vitalità cellulare al di sotto dei livelli soglia definiti (ovvero almeno il 2% per la categoria 50). A seconda del quadro normativo e dell'applicabilità di questo metodo di prova, le sostanze chimiche in esame che producono vitalità cellulare al di sopra di un livello soglia definito possono essere considerate non irritanti (vale a dire, nessuna categoria, almeno il 50%).

Per ricostruire l'epitelio dovrebbero essere utilizzati cheratinociti umani non trasformati. Sotto uno strato corneo funzionale devono esserci molti strati di cellule epiteliali viventi (strato basale, strato spinoso, strato granuloso). Lo strato corneo deve essere multistrato e contenere il profilo lipidico essenziale per formare una barriera funzionale con la tenacità necessaria per resistere alla rapida penetrazione di sostanze chimiche di riferimento citotossiche, ad esempio sodio dodeacil solfato.

La funzione barriera deve essere dimostrata e può essere valutata determinando la concentrazione alla quale una sostanza chimica di riferimento riduce la vitalità tissutale del 50% dopo un tempo di esposizione fisso o determinando il tempo di esposizione richiesto per ridurre la vitalità cellulare del 50% dopo l'applicazione della sostanza chimica di riferimento ad una concentrazione specificata e fissa. Le proprietà di ritenzione del modello RhE (epidermide umana ricostruita) dovrebbero impedire al materiale attorno allo strato corneo di migrare nel tessuto vivente, con conseguente scarsa modellazione dell'esposizione cutanea. Il modello RhE deve essere esente da contaminazioni batteriche, virali, micoplasma o fungine.

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