OECD TG 488 Анализи на генни мутации в соматични и зародишни клетки на трансгенни гризачи

Насоките на ОИСР за отговорно бизнес поведение за мултинационални корпорации (OECD TG 488 „Тестове за генни мутации в соматични и зародишни клетки на трансгенни гризачи“) описват метод за in vivo тестване, използван за откриване на химикали, които причиняват генни мутации в соматичните и зародишните клетки на трансгенни гризачи. Този стандарт е част от „Насоките на ОИСР за тестване на химикали, част 4 „Ефекти върху здравето“ и разглежда значителна празнина в тестването за генотоксичност: директното измерване на генни мутации in vivo в различни тъкани.

За разлика от много in vivo тестове, които се фокусират върху хромозомни увреждания или разкъсвания на ДНК вериги, стандартът TG 488 измерва специфично генните мутации (точкови мутации, малки инсерции/делеции, измествания на рамката на четене). Този стандарт е особено ценен за проследяване на положителни in vitro резултати за мутагенност, изследване на механизми на канцерогенност или оценка на наследствени рискове, произтичащи от мутации в зародишните клетки.

Този метод обикновено следва следните стъпки:

• Животните се третират с изпитвания химикал (по всякакъв начин, включително орално, дермално, инхалационно или имплантиране) за определен период на приложение (обикновено 28 дни).
• Това е последвано от период на симптом/фиксация (времето, необходимо на ДНК лезиите да се превърнат във фиксирани мутации, варира в зависимост от типа тъкан и клетка).
• Животните се евтаназират, тъканите се събират и замразяват.
• Геномната ДНК се извлича от целевите тъкани.
• Трансгените се пакетират във фагови вектори и се прехвърлят в бактерии.
• Мутациите се откриват чрез фенотипни промени (напр. системи за положителна селекция за цветова селекция или делеции).
• Честотата на мутантите се изчислява чрез разделяне на броя на мутантни плаки/колонии на общия получен брой (обикновено насочени към 10^5–10^6 плаки на тъкан на животно).

Този метод на тестване открива широк спектър от мутации и взема предвид in vivo фактори като метаболизъм, фармакокинетика и възстановяване на ДНК.

Елементите на дизайна на изследването са следните:

• Дозировка: За да се осигури съгласуваност с проучванията за токсичност при многократно прилагане, интеграцията и за да се намали броят на животните, обикновено се използва в продължение на 28 последователни дни.
• Времена за вземане на проби: Те зависят от тъканта и целта (по-кратко за бързо делящи се клетки, по-дълго за зародишни клетки или фиксация).
• Проверки: Едновременни отрицателни/носителски проверки, положителни проверки и вземане предвид на исторически данни от проверки.
• Оценка: Решенията за положителен/отрицателен отговор отчитат статистическата значимост, връзката доза-отговор и биологичната значимост (сравнение с исторически контролни данни). Молекулярният анализ на мутанти може да осигури мутационни спектри.
• Потенциал за интеграция: Може да се комбинира с други крайни точки, като например микроядрен (TG 474) или свински-α мутационен анализ при същите животни.

Силните страни на този стандарт са следните:

• Той измерва генни мутации (не само маркери) в почти всяка тъкан.
• Това включва целия метаболизъм и процес на възстановяване на животното.
• Той поддържа както идентифициране на опасностите, така и анализ на механизма на действие.
• Той е гъвкав както за оценка на соматични, така и на зародишни клетки.

Ограниченията на този стандарт са следните:

• Това изисква специализирани трансгенни животни и техническа експертиза (като например фагофагово опаковане).
• Базата данни за зародишни клетки е все още относително ограничена в сравнение с базите данни за соматични тъкани.
• Тестваното вещество или неговите метаболити са неподходящи, ако не достигнат целевата тъкан.

Стандартът OECD TG 488 се използва при оценките за безопасност на химичните вещества (напр. REACH и EPA в Европа) за вещества, които показват мутагенен потенциал in vitro или които пораждат опасения относно наследствени рискове. Това помага при подходите за класификация и етикетиране, основани на доказателства, основани на тегло (напр. мутагени на зародишните клетки).

Текущата работа включва оптимизиране на времето за вземане на проби от зародишни клетки, подобряване на статистическите подходи с исторически контроли и по-голяма интеграция с други тестове за минимизиране на използването на животни.

Това ръководство е надежден, международно съгласуван инструмент за развитие на генетичната токсикология и защита на човешкото здраве от мутагенни опасности.

Накратко, стандартът OECD TG 488 включва международно приет метод за изпитване, използван за оценка дали дадено химично вещество причинява генни мутации в жив организъм (in vivo). Този тест се използва широко в генетичната токсикология, оценката на регулаторния риск и, където е приложимо, оценката на химическата безопасност на фармацевтични продукти, промишлени химикали, пестициди, хранителни добавки и козметични съставки.

Основната цел на този стандарт е да определи дали излагането на дадено вещество причинява следното:

• Соматични клетъчни мутации (мутации в клетките на тялото, които са потенциално свързани с развитието на рак)
• Мутации в зародишните клетки (мутации в сперматозоидите или яйцеклетките, потенциално наследствени)
• Този стандарт оценява мутационните събития в цялата животинска система и обхваща: метаболизъм, абсорбция и разпределение, възстановяване на ДНК и тъканно-специфични реакции.

Това го прави изключително ценен, особено когато резултатите in vitro са положителни или неубедителни и регулаторите се нуждаят от валидиране в биологично релевантен in vivo модел.

Трансгенните гризачи, използвани в тестовете, съдържат обратими репортерни гени. Тези гени са интегрирани в животинския геном. Този метод измерва предимно следното:

• Честота на мутациите
• Мутационен спектър (анализ на секвениране при поискване)
• Тъканно-специфичен мутагенен отговор

Статистически значимото увеличение на честотата на мутантите в сравнение с контролите показва мутагенна активност.

OECD TG 488 запълва важна регулаторна празнина, тъй като много мутагени се държат различно в живите системи, отколкото в клетъчните култури. Основните причини за необходимостта му са следните:

• Това потвърждава дали резултатите от in vitro мутагенността са биологично значими in vivo.
• Открива тъканно-специфична мутагенност.
• Той оценява метаболитно активираните съединения.
• Това подкрепя оценката на канцерогенността.
• Това помага да се оцени рискът от наследствени мутации.

Регулаторните органи обикновено използват стандарта TG 488 в следните ситуации:

• Когато ин витро тестът за генни мутации е положителен
• Когато има опасения относно механизмите на реакция на ДНК
• Когато са необходими допълнителни последващи тестове в рамките на интегрирана стратегия за генотоксичност

В заключение, стандартът OECD TG 488 е изключително важен in vivo тест за мутагенност, който позволява директно откриване на генни мутации в трансгенни гризачи. Той осигурява по-силна биосъвместимост от много in vitro методи и е особено полезен в процесите на вземане на регулаторни решения при оценка на генотоксичния и канцерогенния потенциал на химикалите.

В продължение на много години нашата организация, със своя компетентен и опитен персонал, разбира нуждите на своите клиенти, предоставяйки им необходимите съвременни услуги за тестване и подпомагайки ги при създаването, внедряването и подобряването на системите за управление. В тази рамка, ние също така предоставяме услуги за тестване, съответстващи на стандарта OECD TG 488.