OECD TG 439 体外皮肤刺激：重建人表皮测试方法

《经合组织技术小组 439 体外皮肤刺激：重组人表皮测试方法》标准是根据经合组织关于跨国公司负责任商业行为的指导方针（经合组织指导方针）发布的，描述了一种体外测试方法，用于根据联合国全球统一分类和标签制度（GHS）第 2 类对刺激性化学品（物质和混合物）进行危害识别。

该方法基于重建的人类表皮（RhE），其整体设计密切模仿人类皮肤上部的生化和生理特性。细胞活力通过活体染料 MTT 酶促转化为蓝色甲臜盐来测量，从组织中提取后进行定量测量。刺激性测试物质的定义是其将细胞活力降低至规定阈值水平以下（2 类等于 50% 或更低）的能力。有色化学品也可以使用 HPLC（高效液相色谱）程序进行测试。

共有三种经过验证的测试方法符合 OECD TG 439 标准。根据所使用的监管框架和分类系统，该程序可用于确定测试物质的皮肤刺激性，作为体内皮肤刺激测试的独立替代测试或作为分层测试策略中的部分替代测试。

原则上，测试化学品局部应用于三维 RhE（重建人表皮）模型，该模型由培养的、未转化的人源表皮角质形成细胞组成，以创建多层、高度分化的人表皮模型。它由规则的基底层、多刺层和颗粒层以及含有细胞间层状脂质层的多层角质层组成，这些层状脂质层代表与体内发现的相似的主要脂质类别。

化学物质引起的皮肤刺激主要表现为红斑和水肿，是化学物质穿过角质层并损害角质形成细胞和其他皮肤细胞下层时开始的一系列事件的结果。

受损的细胞可以释放炎症介质或引发炎症级联反应，该级联反应也作用于真皮细胞，尤其是血管的基质细胞和内皮细胞。正是内皮细胞的扩张和通透性增加产生了观察到的红斑和水肿。特别是，当体外测定系统中没有血管形成时，基于 RhE 的测定方法使用细胞活力作为读数来测量级联中的起始事件，例如细胞或组织损伤。

在 RhE 模型中，细胞活力是通过活性染料 MTT 酶促转化为蓝色甲臜盐来测量的，从组织中取出后进行定量测量（MTT 用于评估细胞活力作为氧化还原电位的函数）。刺激性化学物质的定义是其将细胞活力降低至规定阈值水平以下（即第 2 类至少 50%）的能力。根据监管框架和该测试方法的适用性，产生高于定义阈值水平的细胞活力的测试化学品可能被认为是无刺激性的（即，无类别，至少 50%）。

应使用未转化的人角质形成细胞来重建上皮。有功能的角质层下必须有多层活的上皮细胞（基底层、棘层、颗粒层）。角质层必须是多层的，含有必需的脂质成分，以形成具有韧性的功能屏障，以抵抗细胞毒性参考化学品（例如十二烷基硫酸钠）的快速渗透。

必须证明屏障功能，并且可以通过确定参考化学品在固定暴露时间后使组织活力降低 50% 的浓度，或通过确定应用参考化学品后使细胞活力降低 50% 所需的暴露时间来评估在指定的、固定的浓度下。 RhE（重建人表皮）模型的保留特性应防止角质层周围的材料迁移到活体组织中，从而导致皮肤暴露的建模效果不佳。 RhE 模型必须无细菌、病毒、支原体或真菌污染。

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