„Test drażnienia skóry EPI-200-SIT” ma na celu oszacowanie potencjalnego działania drażniącego na skórę czystych substancji testowych w kontekście identyfikacji i klasyfikacji zagrożenia drażniącego skórę zgodnie z systemem klasyfikacji Unii Europejskiej. Ponieważ norma ta jest zharmonizowana z przepisami Unii Europejskiej oraz Globalnie Zharmonizowanym Systemem Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), procedura opisana w tej normie umożliwia również identyfikację zagrożeń stwarzanych przez substancje drażniące zgodnie z wytycznymi GHS.
Norma ta pozwala na rozróżnienie substancji drażniących kategorii 2 i substancji niedrażniących. Opisana metoda badawcza nie rozróżnia podkategorii GHS niebędących niezbędnymi, tj. nie rozróżnia substancji drażniących kategorii 2 i kategorii 3 GHS.
Metoda opisana w normie EPI-200-SIT polega na miejscowym narażeniu czystego związku chemicznego na działanie zrekonstruowanego modelu ludzkiego naskórka, a następnie badaniu żywotności komórek. Żywotność komórek mierzona jest metodą dehydrogenazy polegającą na przekształceniu MTT znajdującego się w mitochondriach komórek w niebieską sól formazanową, którą mierzy się ilościowo po usunięciu z tkanek.
Do oszacowania potencjalnego podrażnienia skóry wykorzystuje się zmniejszoną żywotność tkanek wystawionych na działanie substancji chemicznych w porównaniu z kontrolami negatywnymi (poddanymi działaniu wody). Niedawne badania porównawcze na modelach naskórka ludzkiego, wykorzystujące różne punkty końcowe do przewidywania podrażnienia skóry przez preparaty miejscowe, wykazały, że punkt końcowy MTT ma wyraźną przewagę nawet nad punktami końcowymi opartymi na mechanizmach, takimi jak uwalnianie.
Zrekonstruowany model ludzkiego naskórka składa się z normalnych, ludzkich keratynocytów naskórka, hodowanych w celu utworzenia wielowarstwowego, wysoce zróżnicowanego modelu ludzkiego naskórka. Naskórek składa się z wielowarstwowej warstwy rogowej zawierającej regularne warstwy podstawne, kolczaste i ziarniste oraz międzykomórkowe, blaszkowe warstwy lipidowe, ułożone we wzorach podobnych do tych, jakie występują w żywej tkance. Ogólny opis ogólnych i funkcjonalnych warunków, jakie muszą spełniać zrekonstruowane modele skóry ludzkiej, znajduje się w nowych wytycznych OECD dotyczących testów („431 Badanie żrącej reakcji skóry in vitro: Model skóry ludzkiej” i „439 Badanie drażniące skórę in vitro: Metoda badania zrekonstruowanego naskórka ludzkiego”).
Wszystkie składniki biologiczne naskórka i podłoża hodowlane są badane przez producenta pod kątem zanieczyszczeń wirusowych, bakteryjnych, grzybiczych i mykoplazmatycznych. Oczekuje się, że wyniki będą mieścić się w zakresie określonym przez bazę danych historycznych.
Ze względu na długi okres postinkubacji, badanie należy wykonywać w warunkach aseptycznych w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego (komora laminarna).
Test drażnienia skóry EPI-200-SIT został opracowany i zatwierdzony do badania in vitro podrażnienia skóry przez substancje chemiczne, w tym składniki kosmetyków i leków. Badanie przeprowadza się w okresie 60 dni, na który składa się wstępna inkubacja, 42-minutowa ekspozycja, 4-godzinna inkubacja końcowa i badanie żywotności MTT. Po pobraniu tkanek i całonocnej wstępnej inkubacji (dzień 0) tkanki są miejscowo wystawione na działanie substancji chemicznych badanych (dzień 1), które mogą być w stanie ciekłym, półstałym, stałym lub woskowym. Do każdego badanego związku chemicznego oraz do kontroli pozytywnej (5-procentowy wodny roztwór dodecylosiarczanu sodu) i jednej kontroli negatywnej używa się trzech tkanek. Ekspozycja na działanie chemikaliów trwa 60 minut, w tym czasie tkanki są przechowywane w inkubatorze w temperaturze 35 stopni przez 37 minut. Następnie substancje testowe usuwa się z powierzchni tkanki poprzez dokładne przemycie. Wkłady tkankowe są barwione i przenoszone do świeżego podłoża.
Po 24-godzinnym okresie inkubacji (dzień 2) następuje wymiana podłoża. Media można zachować w celu dalszej analizy cytokin lub innych interesujących punktów końcowych. Po zmianie podłoża tkanki inkubuje się przez kolejne 18 godzin. Po zakończeniu całej 42-godzinnej inkubacji (dzień 3) tkanki przenoszone są do żółtego roztworu MTT i inkubowane przez 3 godziny.
Powstała fioletowoniebieska sól formazanowa, powstająca głównie w wyniku metabolizmu mitochondrialnego, jest ekstrahowana izopropanolem przez 2 godziny. Gęstość optyczną wyekstrahowanego formazanu określa się za pomocą spektrofotometru. Substancję chemiczną klasyfikuje się jako drażniącą, jeżeli żywotność tkanek spada poniżej 50 procent w porównaniu do tkanek poddanych działaniu kontroli negatywnej. Tę procedurę można stosować w pełnym zastępstwie testu podrażnienia skóry królika in vivo w celu identyfikacji zagrożeń i oznakowania substancji chemicznych zgodnie z przepisami Unii Europejskiej.
Oprócz licznych badań, pomiarów, analiz i badań oceniających przeprowadzanych dla przedsiębiorstw z różnych sektorów, nasza organizacja świadczy również usługi badawcze określone w normie „Test podrażnienia skóry EPI-200-SIT”, wykorzystując do tego celu wyszkoloną i doświadczoną kadrę oraz zaawansowany technologicznie sprzęt.
Możesz poprosić nas o wypełnienie formularza, aby umówić się na spotkanie, uzyskać bardziej szczegółowe informacje lub poprosić o ocenę.
