OECD TG 439 Podráždenie pokožky in vitro: Testovacia metóda rekonštruovanej ľudskej epidermy

Norma „OECD TG 439 In vitro podráždenie pokožky: Metóda testovania rekonštituovanej ľudskej epidermy“, publikovaná v rámci usmernení OECD o zodpovednom obchodnom správaní pre nadnárodné spoločnosti (usmernenia OECD) , opisuje testovaciu metódu in vitro používanú na identifikáciu nebezpečnosti dráždivých chemikálií (látok a zmesí) v súlade s kategóriou 2 Globálneho harmonizovaného systému klasifikácie a označovania (GHS) OSN.

Táto metóda je založená na rekonštruovanej ľudskej epiderme (RhE), ktorá vo svojom celkovom dizajne verne napodobňuje biochemické a fyziologické vlastnosti vrchných častí ľudskej kože. Životaschopnosť buniek sa meria enzymatickou konverziou vitálneho farbiva MTT na modrú formazanovú soľ, ktorá sa meria kvantitatívne po extrakcii z tkanív. Dráždivé testované látky sú definované svojou schopnosťou znížiť životaschopnosť buniek pod definované prahové úrovne (rovnajúce sa 2 percentám alebo menej pre kategóriu 50). Farebné chemikálie možno testovať aj pomocou postupu HPLC (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia).

Existujú tri overené testovacie metódy, ktoré sú v súlade s normou OECD TG 439. V závislosti od použitého regulačného rámca a klasifikačného systému sa tento postup môže použiť na určenie podráždenia kože testovanými látkami ako samostatný náhradný test na testovanie podráždenia kože in vivo alebo ako čiastočný náhradný test v rámci viacúrovňovej testovacej stratégie.

V zásade sa testovaná chemikália aplikuje lokálne na trojrozmerný model RhE (rekonštruovaná ľudská epidermis), ktorý pozostáva z kultivovaných, netransformovaných epidermálnych keratinocytov získaných z človeka, aby sa vytvoril viacvrstvový, vysoko diferencovaný model ľudskej epidermy. Pozostáva z pravidelných bazálnych, ostnatých a granulárnych vrstiev a viacvrstvovej stratum corneum obsahujúcej medzibunkové lamelárne lipidové vrstvy predstavujúce hlavné lipidové triedy podobné tým, ktoré sa nachádzajú in vivo.

Chemické podráždenie kože sa prejavuje predovšetkým erytémom a edémom a je výsledkom kaskády udalostí, ktoré sa začínajú, keď chemikálie prechádzajú cez stratum corneum a poškodzujú spodné vrstvy keratinocytov a iných kožných buniek.

Poškodené bunky môžu uvoľniť zápalové mediátory alebo spustiť zápalovú kaskádu, ktorá pôsobí aj na bunky v derme, najmä na stromálne a endoteliálne bunky krvných ciev. Je to expanzia a zvýšená permeabilita endotelových buniek, ktorá produkuje pozorovaný erytém a edém. Konkrétne, testovacie metódy založené na RhE merajú iniciačné udalosti v kaskáde, ako je poškodenie buniek alebo tkaniva, pomocou bunkovej životaschopnosti ako výsledku, keď v in vitro testovacom systéme nie je žiadna vaskularizácia.

V modeli RhE sa životaschopnosť buniek meria enzymatickou konverziou vitálneho farbiva MTT na modrú formazanovú soľ, ktorá sa meria kvantitatívne po odstránení z tkanív (MTT sa používa na hodnotenie životaschopnosti buniek ako funkcie redoxného potenciálu). Dráždivé chemikálie sú definované svojou schopnosťou znížiť životaschopnosť buniek pod definované prahové úrovne (t. j. aspoň o 2 percent pre kategóriu 50). V závislosti od regulačného rámca a použiteľnosti tejto testovacej metódy sa testované chemikálie, ktoré vytvárajú životaschopnosť buniek nad definovanou prahovou úrovňou, môžu považovať za nedráždivé (t. j. žiadna kategória, aspoň 50 percent).

Na rekonštrukciu epitelu sa majú použiť netransformované ľudské keratinocyty. Pod funkčnou stratum corneum musí byť veľa vrstiev živých epitelových buniek (bazálna vrstva, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum musí byť viacvrstvové, obsahujúce esenciálny lipidový profil na vytvorenie funkčnej bariéry s húževnatosťou odolávajúcou rýchlemu prenikaniu cytotoxických referenčných chemikálií, napr. dodeacylsulfátu sodného.

Bariérová funkcia sa musí preukázať a možno ju vyhodnotiť stanovením koncentrácie, pri ktorej referenčná chemikália znižuje životaschopnosť tkaniva o 50 percent po pevne stanovenom čase expozície, alebo určením času expozície potrebného na zníženie životaschopnosti buniek o 50 percent po aplikácii referenčnej chemikálie v stanovenej, pevnej koncentrácii. Retenčné vlastnosti modelu RhE (rekonštruovaná ľudská epidermis) by mali zabrániť migrácii materiálu okolo stratum corneum do živého tkaniva, čo má za následok zlé modelovanie expozície kože. Model RhE musí byť bez bakteriálnej, vírusovej, mykoplazmovej alebo plesňovej kontaminácie.

Spomedzi početných testovacích, meracích, analytických a hodnotiacich štúdií, ktoré naša organizácia poskytuje pre podniky v rôznych sektoroch, so svojim vyškoleným a odborným personálom a pokročilým technologickým vybavením poskytujeme aj testovacie služby definované v „OECD TG 439 In vitro podráždenie pokožky: Rekonštruovaný ľudský epidermis testovacia metóda“ štandard.udáva.