La “Prueba de irritación cutánea EPI-200-SIT” está diseñada para estimar el potencial de irritación cutánea de sustancias de prueba puras en el contexto de la identificación y clasificación del peligro de irritación cutánea según el sistema de clasificación de la Unión Europea. Al estar armonizado con la Unión Europea y el Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (GHS), el procedimiento descrito en esta norma también permite la identificación de peligros de irritantes de acuerdo con el GHS.
Esta norma permite distinguir entre irritantes y no irritantes de categoría 2. El método de prueba descrito no distingue entre subcategorías no esenciales del GHS, es decir, no distingue entre irritantes de categoría 2 y 3 del GHS.
El método descrito en la norma EPI-200-SIT consiste en la exposición tópica de la sustancia problema pura a un modelo reconstruido de epidermis humana seguida de pruebas de viabilidad celular. La viabilidad celular se mide mediante la conversión deshidrogenasa de MTT, que está presente en las mitocondrias celulares y se convierte en una sal azul de formazán, que se mide cuantitativamente después de su eliminación de los tejidos.
La viabilidad reducida de los tejidos expuestos a sustancias químicas en comparación con los controles negativos (tratados con agua) se utiliza para estimar el potencial de irritación de la piel. Estudios comparativos recientes en modelos de epidermis humana que utilizan varios criterios de valoración para predecir la irritación de la piel de formulaciones tópicas han demostrado que el criterio de valoración MTT tiene claras ventajas incluso sobre los criterios de valoración mecánicos, como la liberación.
El modelo epidérmico humano reconstruido consta de queratinocitos epidérmicos normales de origen humano cultivados para formar un modelo de epidermis humana de múltiples capas y altamente diferenciado. Consiste en capas basales, espinosas y granulares regulares y un estrato córneo multicapa que contiene capas lipídicas laminares intercelulares dispuestas en patrones similares a los que se encuentran en el tejido vivo. Una descripción general de las condiciones generales y funcionales que deben cumplir los modelos de piel humana reconstruida se incluye en las nuevas directrices de prueba de la OCDE (“431 Corrosión de la piel in vitro: modelo de piel humana” y “439 Irritación de la piel in vitro: método de prueba de epidermis humana reconstruida”) ”).
El fabricante analiza todos los componentes biológicos de la epidermis y el medio de cultivo para detectar contaminación viral, bacteriana, fúngica y micoplasma. Se espera que los resultados estén dentro de un rango determinado por la base de datos histórica.
Debido al largo tiempo de posincubación, la prueba debe realizarse en condiciones asépticas en una cabina de seguridad microbiológica (campana de flujo laminar).
La prueba de irritación cutánea EPI-200-SIT fue desarrollada y validada para pruebas de irritación cutánea in vitro de productos químicos, incluidos ingredientes cosméticos y farmacéuticos. Las pruebas se realizan durante un período de 60 días que consta de preincubación, exposición de 42 minutos, postincubación de 4 horas y pruebas de viabilidad MTT. Después de la recolección del tejido y la preincubación durante la noche (día 0), los tejidos se exponen tópicamente a las sustancias problema (día 1), que pueden ser líquidas, semisólidas, sólidas o cera. Se utilizan tres tejidos para cada sustancia problema y un control positivo (solución acuosa de dodecilsulfato de sodio al 5 por ciento) y un control negativo. La exposición química dura 60 minutos, de los cuales 35 minutos los tejidos se mantienen en una incubadora a 37 grados. A continuación, las sustancias problema se eliminan de la superficie del tejido mediante un extenso proceso de lavado. Los insertos de tejido se tiñen y se transfieren a un medio nuevo.
Después de un período de incubación de 24 horas (día 2), se cambia el medio. Los medios se pueden guardar para análisis adicionales de citocinas u otros criterios de valoración de interés. Después del cambio de medio, los tejidos se incuban durante 18 horas más. Después de las 42 horas completas de incubación (día 3), los tejidos se transfieren a una solución de MTT amarilla y se incuban durante 3 horas.
La sal de formazán azul púrpura resultante, formada principalmente por metabolismo mitocondrial, se extrae usando isopropanol durante 2 h. La densidad óptica del formazán extraído se determina utilizando un espectrofotómetro. Una sustancia química se clasifica como irritante si la viabilidad del tejido cae por debajo del 50 por ciento en relación con los tejidos tratados con un control negativo. Este procedimiento se puede utilizar como un reemplazo completo de la prueba de irritación de la piel de conejos in vivo para la identificación de peligros y el etiquetado de productos químicos de acuerdo con las regulaciones de la Unión Europea.
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