Para las pruebas de biocompatibilidad que requieren genotoxicidad, ofrecemos varios tipos de pruebas, que incluyen mutagenicidad de Ames, aberración cromosómica, linfoma de ratón y micronúcleo de ratón, según el tipo de producto y los requisitos de datos. Estas pruebas cumplen con las directrices de la OCDE e ISO como uno de los tres niveles de prueba in vitro de genotoxicidad.
La prueba de mutagenicidad de Ames se utiliza para determinar la actividad mutagénica potencial de un extracto de un dispositivo / material médico. La prueba de mutación inversa bacteriana (prueba de Ames) se realiza como parte de la batería de pruebas de genotoxicidad para determinar si las fugas de un dispositivo / material médico son mutagénicas.
La prueba de aberración cromosómica se utiliza para escanear dispositivos / suministros médicos para determinar si están causando anomalías cromosómicas estructurales en las células del ovario de hámster chino (CHO). La prueba se realiza en dispositivos / materiales con contacto permanente con el paciente, contacto prolongado con el paciente o contacto con sangre. La prueba de aberración cromosómica cumple con las directrices de la OCDE e ISO como uno de los tres niveles de pruebas in vitro de genotoxicidad.
Las pruebas de linfoma de ratón a menudo utilizan cultivos de células de mamíferos para identificar mutaciones genéticas, cambios en la estructura y número de cromosomas y otras toxicidades genéticas causadas por dispositivos médicos, material o extractos. Estas pruebas se utilizan para garantizar que los dispositivos que tienen contacto a largo plazo con el cuerpo no revelen genotoxicidad que podría conducir a mutaciones genéticas con potencial de cáncer.
El ensayo Mouse Micronucleus se utiliza para evaluar el potencial de un dispositivo médico para inducir la formación de micronúcleos en eritrocitos policromáticos inmaduros que se encuentran en la médula ósea de ratones adultos.
Mutagenicidad de Ames
La prueba de mutagenicidad de Ames utiliza varias cepas de Salmonella typhimurium seleccionadas por su susceptibilidad a la mutación debido a:
Las cepas de prueba también requieren histidina para el crecimiento debido a una mutación en el gen que controla la producción de histidina. Las pruebas de Ames se realizan mezclando un extracto de la sustancia de prueba con el organismo de prueba en una solución de agar blando que contiene solo una pequeña cantidad de histidina. La histidina permite que el organismo de prueba inoculado entre en un número limitado de compartimentos, pero es insuficiente para permitir un crecimiento normal.
Sin embargo, si la cepa se somete a una mutación inversa (espontánea o inducida por la sustancia de prueba o un material de control positivo), el organismo ya no necesita histidina para crecer y puede producir una colonia visible o reversible. Las mutaciones en el organismo de prueba solo en la región del gen de la histidina hacen que el organismo de prueba invierta la mutación en un organismo, que ya no requiere histidina.
Las cepas de prueba se seleccionan para detectar varios tipos de mutágenos. Las cepas de prueba utilizadas son TA97A, TA98, TA100, TA102 y TA1535. También se realiza una prueba puntual en la que se tiñen extractos del producto de prueba en una placa que contiene una pequeña cantidad de organismo de prueba que contiene histidina. A medida que la sustancia de ensayo se esparce por el agar, se diluye más. Esto permite la detección de mutágenos que provocan cierta inhibición de las cepas del tester. Las pruebas se realizan con activación S-9 o sin activación S-9. El sistema de activación S-9 está diseñado para simular sistemas de enzimas hepáticas de mamíferos y se utiliza para detectar sustancias que experimentan activación metabólica a partir de formas no mutagénicas.
La prueba de aberración cromosómica se realiza exponiendo las células CHO al extracto de la sustancia de prueba. Se incluye un medio de sangrado en el ensayo como control negativo.
Se siembran células CHO en matraces de cultivo celular de 75 cm2 y se incuban con medio de cultivo celular + suero al 10% hasta una confluencia del 40-60%.
Las células CHO se exponen al extracto del producto de prueba en presencia y ausencia de un sistema de activación metabólica. El sistema de activación metabólica es una mezcla de homogeneizado S9, isocitrato y NADP. Los controles positivos utilizados son Ciclofosfamida con activación metabólica y Mitomicina C sin activación metabólica.
Antes de la recolección celular, se examinan las células para determinar su citotoxicidad. Los viales se puntúan según el grado de citotoxicidad morfológica distinguible en una escala relativa de 10993 a 5 según AAMI / ANSI / ISO 87-0 y USP <4>. El promedio de los resultados de los tres frascos se promedia para dar una puntuación de citotoxicidad final.
Al final de los períodos de exposición y expresión, las células se detienen en la metafase con coltazida. A continuación, las células se extraen de los viales y se tratan con una solución hipotónica y un fijador. Las células se depositan en portaobjetos de microscopio. Los cromosomas se tiñen con tinción de Giemsa y se cubren con Permount®. Luego, las células se examinan microscópicamente en busca de anomalías cromosómicas.
Biocompatibilidad En la prueba de genotoxicidad, las células de linfoma de ratón se utilizan para determinar si un material de prueba es capaz de inducir mutaciones puntuales o clastogénicas (rotura cromosómica) en una línea de células de mamífero cultivadas. En este caso, el gen diana, la timidina quinasa (TK), es un gen prescindible. La pérdida de actividad de los TK indica que se ha producido una mutación. Dado que la TK está involucrada en una vía de rescate derivada del metabolismo del ADN, las células pueden sintetizar timidina de novo. Por lo tanto, la pérdida de TK no inanima la célula.
Se pueden seleccionar mutantes y se pueden derivar frecuencias de mutantes incorporando el análogo de timidina (trifluorotimidina o TFT) en el medio de cultivo de células después de la exposición al material de prueba. Las células regulares con TK intacto incluyen análogo y plantilla; Las células mutantes (que carecen de actividad TK) sobreviven, forman colonias y se cuantifican.
En la prueba de micronúcleo de ratón, se extrae un dispositivo médico en un entorno polar y no polar. Los controles positivos y los controles negativos del extracto del producto de prueba se administran a 20 ml / kg en ratones machos y hembras. A continuación, se extrae la médula ósea 24 y 48 horas después de la dosificación y se examina la presencia de eritrocitos policromáticos micronucleares (PCE). La presencia de PCE es una indicación de la sustancia mutagénica que se escapa del dispositivo.
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