O “Teste de irritação cutânea EPI-200-SIT” foi concebido para estimar o potencial de irritação cutânea de substâncias de teste puras no contexto da identificação e classificação do perigo de irritação cutânea de acordo com o sistema de classificação da União Europeia. Por estar harmonizado com a União Europeia e com o Sistema Globalmente Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS), o procedimento descrito nesta norma também permite a identificação de perigos de irritantes de acordo com o GHS.
Este padrão permite a distinção entre irritantes e não irritantes da categoria 2. O método de ensaio descrito não faz distinção entre subcategorias não essenciais do GHS, ou seja, não faz distinção entre irritantes da categoria 2 e da categoria 3 do GHS.
O método descrito na norma EPI-200-SIT consiste na exposição tópica do produto químico em estudo puro a um modelo reconstruído de epiderme humana, seguida de testes de viabilidade celular. A viabilidade celular é medida pela conversão da desidrogenase do MTT, que está presente nas mitocôndrias celulares e é convertido em um sal de formazano azul, que é medido quantitativamente após a remoção dos tecidos.
A viabilidade reduzida dos tecidos expostos a produtos químicos em comparação com controlos negativos (tratados com água) é utilizada para estimar o potencial de irritação da pele. Estudos comparativos recentes em modelos de epiderme humana usando vários parâmetros para prever a irritação da pele de formulações tópicas mostraram que o parâmetro MTT tem vantagens distintas até mesmo em relação aos parâmetros de base mecânica, como a liberação.
O modelo epidérmico humano reconstruído consiste em queratinócitos epidérmicos normais de origem humana cultivados para formar um modelo de epiderme humana altamente diferenciado e multicamadas. Consiste em camadas basais, espinhosas e granulares regulares e um estrato córneo multicamadas contendo camadas lipídicas lamelares intercelulares dispostas em padrões semelhantes aos encontrados em tecidos vivos. Uma descrição geral das condições gerais e funcionais que os modelos de pele humana reconstruída devem cumprir está incluída nas novas diretrizes de teste da OCDE (“431 Corrosão cutânea in vitro: modelo de pele humana” e “439 Irritação cutânea in vitro: Método de teste de epiderme humana reconstruída ”).
Todos os componentes biológicos da epiderme e do meio de cultura são testados pelo fabricante quanto à contaminação viral, bacteriana, fúngica e por micoplasma. Espera-se que os resultados estejam dentro de um intervalo determinado pela base de dados histórica.
Devido ao longo tempo pós-incubação, o teste deve ser realizado em condições assépticas em cabine de segurança microbiológica (capuz de fluxo laminar).
O teste de irritação cutânea EPI-200-SIT foi desenvolvido e validado para testes in vitro de irritação cutânea de produtos químicos, incluindo ingredientes cosméticos e farmacêuticos. O teste é realizado durante um período de 60 dias que consiste em pré-incubação, exposição de 42 minutos, pós-incubação de 4 horas e testes de viabilidade do MTT. Após a colheita do tecido e a pré-incubação durante a noite (dia 0), os tecidos são expostos topicamente aos produtos químicos em estudo (dia 1), que podem ser líquidos, semissólidos, sólidos ou cera. São utilizados três tecidos para cada produto químico em estudo e um controlo positivo (solução aquosa de dodecilsulfato de sódio a 5 por cento) e um controlo negativo. A exposição química dura 60 minutos, dos quais 35 minutos os tecidos são mantidos em incubadora a 37 graus. As substâncias de teste são então removidas da superfície do tecido através de um extenso procedimento de lavagem. As inserções de tecido são coradas e transferidas para meio fresco.
Após um período de incubação de 24 horas (dia 2), o meio é trocado. A mídia pode ser salva para análise posterior de citocinas ou outros pontos finais de interesse. Após a mudança do meio, os tecidos são incubados durante mais 18 horas. Após todas as 42 horas de incubação (dia 3), os tecidos são transferidos para solução amarela de MTT e incubados durante 3 horas.
O sal de formazan azul-púrpura resultante, formado principalmente pelo metabolismo mitocondrial, é extraído com isopropanol por 2 h. A densidade óptica do formazan extraído é determinada utilizando um espectrofotômetro. Um produto químico é classificado como irritante se a viabilidade do tecido cair abaixo de 50% em relação aos tecidos tratados com controle negativo. Este procedimento pode ser usado como um substituto completo para o teste in vivo de irritação da pele do coelho para identificação de perigos e rotulagem de produtos químicos de acordo com os regulamentos da União Europeia.
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