Para testes de biocompatibilidade que requerem genotoxicidade, oferecemos vários tipos de teste, incluindo mutagenicidade de Ames, aberração cromossômica, linfoma de camundongo e micronúcleo de camundongo, dependendo do tipo de produto e dos requisitos de dados. Esses testes estão de acordo com as diretrizes da OCDE e ISO como um dos três níveis de teste in vitro para genotoxicidade.
O teste de mutagenicidade Ames é usado para determinar a potencial atividade mutagênica de um extrato de um dispositivo / material médico. O teste de mutação reversa bacteriana (teste de Ames) é realizado como parte da bateria de testes de genotoxicidade para determinar se os vazamentos de um dispositivo / material médico são mutagênicos.
O teste de aberração cromossômica é usado para examinar dispositivos / suprimentos médicos para determinar se eles estão causando anormalidades cromossômicas estruturais nas células do ovário do hamster chinês (CHO). O teste é realizado em dispositivos / materiais com contato permanente com o paciente, contato prolongado com o paciente ou contato com sangue. O teste de aberração cromossômica está em conformidade com as diretrizes da OECD e ISO como um dos três níveis de teste in vitro para genotoxicidade.
Os testes de linfoma em camundongos geralmente usam culturas de células de mamíferos para identificar mutações genéticas, mudanças na estrutura e número dos cromossomos e outras toxicidades gênicas causadas por dispositivos médicos, materiais ou extratos. Esses testes são usados para garantir que os dispositivos que têm contato de longo prazo com o corpo não revelem genotoxicidade que poderia levar a mutações genéticas com potencial de câncer.
O ensaio de micronúcleo de camundongo é usado para avaliar o potencial de um dispositivo médico para induzir a formação de micronúcleo em eritrócitos policromáticos imaturos encontrados na medula óssea de camundongos adultos.
Mutagenicidade de Ames
O teste de mutagenicidade de Ames usa várias cepas de Salmonella typhimurium selecionadas por sua suscetibilidade à mutação devido a:
As cepas de teste também requerem histidina para o crescimento devido a uma mutação no gene que controla a produção de histidina. Os testes de Ames são realizados misturando um extrato da substância em estudo com o organismo em estudo em uma solução de ágar mole contendo apenas uma pequena quantidade de histidina. A histidina permite que o organismo de teste inoculado entre em um número limitado de compartimentos, mas é insuficiente para permitir o crescimento normal.
No entanto, se a cepa sofrer uma mutação reversa (espontânea ou induzida pela substância de teste ou um material de controle positivo), o organismo não precisa mais de histidina para crescer e pode produzir uma colônia visível ou reversor. Mutações no organismo de teste apenas na região do gene da histidina fazem com que o organismo de teste reverta a mutação em um organismo, que não requer mais histidina.
As cepas de teste são selecionadas para detectar vários tipos de mutagênicos. As cepas de teste usadas são TA97A, TA98, TA100, TA102 e TA1535. Um teste local também é realizado no qual extratos do produto de teste são corados em uma placa contendo uma pequena quantidade de organismo de teste contendo histidina. À medida que a substância de teste se difunde pelo ágar, ela se torna mais diluída. Isso permite a detecção de agentes mutagênicos que causam alguma inibição das cepas testadoras. Os testes são feitos com ativação S-9 ou sem ativação S-9. O sistema de ativação S-9 é projetado para simular sistemas de enzimas hepáticas de mamíferos e é usado para detectar substâncias que sofrem ativação metabólica de formas não mutagênicas.
O teste de aberração cromossômica é realizado expondo as células CHO ao extrato da substância de teste. Um meio de sangria é incluído no ensaio como um controle negativo.
As células CHO são semeadas em frascos de cultura de células de 75 cm 2 e incubadas com meio de cultura de células + 10% de soro até 40-60% de confluência.
As células CHO são expostas ao extrato do produto de teste na presença e ausência de um sistema de ativação metabólica. O sistema de ativação metabólica é uma mistura de homogenato S9, isocitrato e NADP. Os controles positivos utilizados são Ciclofosfamida com ativação metabólica e Mitomicina C sem ativação metabólica.
Antes da colheita das células, as células são examinadas quanto à citotoxicidade. Os frascos são pontuados de acordo com o grau de citotoxicidade morfológica distinguível em uma escala relativa de 10993 - 5 de acordo com AAMI / ANSI / ISO 87-0 e USP <4>. A média dos resultados das três garrafas é calculada para dar uma pontuação final de citotoxicidade.
No final dos períodos de exposição e expressão, as células são paradas na metáfase com coltazida. As células são então removidas dos frascos e tratadas com uma solução hipotônica e fixador. As células são depositadas em lâminas de microscópio. Os cromossomos são corados com a coloração Giemsa e cobertos com Permount®. As células são então examinadas microscopicamente para anormalidades cromossômicas.
Biocompatibilidade Em testes de genotoxicidade, células de linfoma de camundongo são usadas para determinar se um material de teste é capaz de induzir mutações pontuais ou clastogênica (quebra cromossômica) em uma linha de células de cultura de mamíferos. Nesse caso, o gene alvo, a timidina quinase (TK), é um gene dispensável. A perda de atividade de TK indica que ocorreu uma mutação. Uma vez que o TK está envolvido em uma via de resgate derivada do metabolismo do DNA, as células podem sintetizar a timidina de novo. Portanto, a perda de TK não torna a célula inanimada.
Os mutantes podem ser selecionados e as frequências mutantes podem ser derivadas incorporando o análogo da timidina (trifluorotimidina ou TFT) no meio de cultura das células após a exposição ao material de teste. As células regulares com TK intacto incluem analógico e molde; As células mutantes (sem atividade de TK) sobrevivem, formam colônias e quantificam.
No teste de micronúcleo de camundongo, um dispositivo médico é removido em um ambiente polar e não polar. Os controles positivos e negativos do extrato do produto de teste são administrados a 20 mL / kg em camundongos machos e fêmeas. A medula óssea é então colhida 24 e 48 horas após a dosagem e examinada quanto à presença de eritrócitos policromáticos micronucleares (PCEs). A presença de PCEs é uma indicação do vazamento da substância mutagênica do dispositivo.
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