Der Standard „OECD TG 439 In vitro skin irrigation: reconstitued human epidermis test method“, der im Rahmen der OECD-Leitlinien für verantwortungsvolles unternehmerisches Handeln multinationaler Unternehmen (OECD-Leitlinien) veröffentlicht wurde , beschreibt eine In-vitro-Testmethode zur Gefahrenidentifizierung von reizenden Chemikalien (Stoffen und Gemischen) gemäß der Kategorie 2 des Global Harmonized Classification and Labeling System (GHS) der Vereinten Nationen.
Diese Methode basiert auf rekonstruierter menschlicher Epidermis (RhE), die in ihrem Gesamtdesign die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der oberen Teile der menschlichen Haut genau nachahmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch die enzymatische Umwandlung des lebenswichtigen Farbstoffs MTT in das blaue Formazansalz gemessen, das nach der Extraktion aus Geweben quantitativ gemessen wird. Reizende Testsubstanzen werden durch ihre Fähigkeit definiert, die Lebensfähigkeit der Zellen unter definierte Schwellenwerte zu reduzieren (entspricht 2 Prozent oder weniger für Kategorie 50). Farbige Chemikalien können auch mit einem HPLC-Verfahren (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) getestet werden.
Es gibt drei validierte Testmethoden, die dem OECD TG 439-Standard entsprechen. Abhängig vom regulatorischen Rahmen und dem verwendeten Klassifizierungssystem kann dieses Verfahren zur Bestimmung der Hautreizung von Testsubstanzen als eigenständiger Ersatztest für die In-vivo-Hautreizungsprüfung oder als teilweiser Ersatztest im Rahmen einer abgestuften Teststrategie verwendet werden.
Im Prinzip wird die Prüfchemikalie topisch auf ein dreidimensionales RhE-Modell (rekonstruierte menschliche Epidermis) aufgetragen, das aus kultivierten, nicht transformierten menschlichen epidermalen Keratinozyten besteht, um ein mehrschichtiges, hochdifferenziertes Modell der menschlichen Epidermis zu erstellen. Es besteht aus regelmäßigen Basal-, Stachel- und Körnerschichten und einem mehrschichtigen Stratum corneum, das interzelluläre lamellare Lipidschichten enthält, die wichtige Lipidklassen darstellen, die denen in vivo ähneln.
Durch Chemikalien verursachte Hautreizungen äußern sich hauptsächlich in Erythemen und Ödemen und sind das Ergebnis einer Kaskade von Ereignissen, die beginnt, wenn Chemikalien durch das Stratum Corneum dringen und die unteren Schichten von Keratinozyten und anderen Hautzellen schädigen.
Geschädigte Zellen können Entzündungsmediatoren freisetzen oder eine Entzündungskaskade auslösen, die auch auf Zellen in der Dermis, insbesondere die Stroma- und Endothelzellen der Blutgefäße, wirkt. Es ist die Ausdehnung und erhöhte Permeabilität der Endothelzellen, die zu den beobachteten Erythemen und Ödemen führt. RhE-basierte Testmethoden messen insbesondere auslösende Ereignisse in der Kaskade, wie z. B. Zell- oder Gewebeschäden, wobei die Lebensfähigkeit der Zellen als Messwert verwendet wird, wenn im In-vitro-Testsystem keine Vaskularisierung vorliegt.
Im RhE-Modell wird die Zelllebensfähigkeit durch die enzymatische Umwandlung des lebenswichtigen Farbstoffs MTT in das blaue Formazansalz gemessen, das nach der Entfernung aus dem Gewebe quantitativ gemessen wird (MTT wird zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit als Funktion des Redoxpotentials verwendet). Reizende Chemikalien werden durch ihre Fähigkeit definiert, die Lebensfähigkeit der Zellen unter definierte Schwellenwerte zu reduzieren (d. h. mindestens 2 Prozent für Kategorie 50). Abhängig vom regulatorischen Rahmen und der Anwendbarkeit dieser Testmethode können Testchemikalien, die eine Zelllebensfähigkeit über einem definierten Schwellenwert erreichen, als nicht reizend angesehen werden (d. h. keine Kategorie, mindestens 50 Prozent).
Zur Rekonstruktion des Epithels sollten untransformierte menschliche Keratinozyten verwendet werden. Unter einem funktionsfähigen Stratum corneum müssen sich viele Schichten lebender Epithelzellen befinden (Basalschicht, Stratum spinosum, Stratum granulosum). Das Stratum corneum muss mehrschichtig sein und das essentielle Lipidprofil enthalten, um eine funktionelle Barriere zu bilden, die robust genug ist, um einem schnellen Eindringen zytotoxischer Referenzchemikalien, z. B. Natriumdodeacylsulfat, zu widerstehen.
Die Barrierefunktion muss nachgewiesen werden und kann bewertet werden, indem die Konzentration bestimmt wird, bei der eine Referenzchemikalie die Lebensfähigkeit des Gewebes nach einer festgelegten Einwirkungszeit um 50 Prozent verringert, oder indem die Einwirkungszeit bestimmt wird, die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach Anwendung der Referenzchemikalie um 50 Prozent zu verringern in einer festgelegten, festen Konzentration. Die Retentionseigenschaften des RhE-Modells (rekonstruierte menschliche Epidermis) sollten verhindern, dass Material rund um das Stratum Corneum in lebendes Gewebe wandert, was zu einer schlechten Modellierung der Hautexposition führt. Das RhE-Modell muss frei von Bakterien, Viren, Mykoplasmen oder Pilzen sein.
Neben den zahlreichen Test-, Mess-, Analyse- und Bewertungsstudien, die unsere Organisation mit geschultem und fachkundigem Personal und fortschrittlicher technologischer Ausrüstung für Unternehmen in verschiedenen Branchen durchführt, bieten wir auch Testdienstleistungen an, die in der „OECD TG 439 In-vitro-Hautreizung: Rekonstruierter Mensch“ definiert sind Epidermis-Testmethode"-Standard. Gibt.
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