Der „EPI-200-SIT Hautreizungstest“ dient der Abschätzung des Hautreizungspotenzials reiner Testsubstanzen im Rahmen der Identifizierung und Klassifizierung von Hautreizungsgefahren gemäß dem Klassifizierungssystem der Europäischen Union. Da es mit der Europäischen Union und dem Global Harmonisierten System zur Klassifizierung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) harmonisiert ist, ermöglicht das in dieser Norm beschriebene Verfahren auch die Gefahrenidentifizierung von Reizstoffen gemäß GHS.
Diese Norm ermöglicht die Unterscheidung zwischen reizenden und nicht reizenden Stoffen der Kategorie 2. Das beschriebene Testverfahren unterscheidet nicht zwischen nicht wesentlichen Unterkategorien von GHS, d. h. es unterscheidet nicht zwischen Reizstoffen der GHS-Kategorie 2 und der Kategorie 3.
Die im EPI-200-SIT-Standard beschriebene Methode besteht aus der topischen Exposition einer reinen Testchemikalie gegenüber einem rekonstruierten Modell der menschlichen Epidermis, gefolgt von einem Test der Zelllebensfähigkeit. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch die Dehydrogenase-Umwandlung von MTT gemessen, das in den Zellmitochondrien vorhanden ist und in ein blaues Formazansalz umgewandelt wird, das nach der Entfernung aus dem Gewebe quantitativ gemessen wird.
Die verringerte Lebensfähigkeit von Geweben, die Chemikalien ausgesetzt sind, im Vergleich zu Negativkontrollen (wasserbehandelt) wird zur Abschätzung des Potenzials für Hautreizungen herangezogen. Jüngste Vergleichsstudien an menschlichen Epidermismodellen, die verschiedene Endpunkte zur Vorhersage der Hautreizung topischer Formulierungen verwenden, haben gezeigt, dass der MTT-Endpunkt deutliche Vorteile gegenüber selbst mechanisch basierten Endpunkten wie der Freisetzung hat.
Das rekonstruierte menschliche Epidermismodell besteht aus normalen, vom Menschen stammenden epidermalen Keratinozyten, die kultiviert wurden, um ein mehrschichtiges, hochdifferenziertes Modell der menschlichen Epidermis zu bilden. Es besteht aus regelmäßigen Basal-, Stachel- und Körnerschichten und einem mehrschichtigen Stratum corneum, das interzelluläre lamellare Lipidschichten enthält, die in Mustern angeordnet sind, die denen in lebendem Gewebe ähneln. Eine allgemeine Beschreibung der allgemeinen und funktionellen Bedingungen, die rekonstruierte menschliche Hautmodelle erfüllen müssen, finden Sie in den neuen OECD-Testrichtlinien („431 In vitro Skin Corrosion: Human Skin Model“ und „439 In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method“) “).
Alle biologischen Bestandteile der Epidermis und des Kulturmediums werden vom Hersteller auf Virus-, Bakterien-, Pilz- und Mykoplasmenkontamination getestet. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse innerhalb eines durch die historische Datenbank festgelegten Bereichs liegen.
Aufgrund der langen Nachinkubationszeit muss der Test unter aseptischen Bedingungen in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank (Laminar-Flow-Haube) durchgeführt werden.
Der Hautreizungstest EPI-200-SIT wurde für die In-vitro-Hautreizungsprüfung von Chemikalien, einschließlich kosmetischer und pharmazeutischer Inhaltsstoffe, entwickelt und validiert. Die Tests werden über einen Zeitraum von 60 Tagen durchgeführt und bestehen aus Vorinkubation, 42-minütiger Exposition, 4-stündiger Nachinkubation und MTT-Lebensfähigkeitstests. Nach der Gewebeentnahme und der Vorinkubation über Nacht (Tag 0) werden die Gewebe lokal Testchemikalien ausgesetzt (Tag 1), die flüssig, halbfest, fest oder Wachs sein können. Für jede Testchemikalie werden drei Gewebe sowie eine Positivkontrolle (5-prozentige wässrige Natriumdodecylsulfatlösung) und eine Negativkontrolle verwendet. Die chemische Einwirkung dauert 60 Minuten, davon werden die Gewebe 35 Minuten in einem Inkubator bei 37 Grad aufbewahrt. Anschließend werden die Testsubstanzen durch einen aufwendigen Waschvorgang von der Gewebeoberfläche entfernt. Gewebeeinsätze werden gefärbt und auf frisches Medium übertragen.
Nach einer 24-stündigen Inkubationszeit (Tag 2) wird das Medium gewechselt. Medien können für die weitere Analyse von Zytokinen oder anderen interessierenden Endpunkten gespeichert werden. Nach dem Medienwechsel werden die Gewebe weitere 18 Stunden lang inkubiert. Nach der gesamten 42-stündigen Inkubation (Tag 3) werden die Gewebe in gelbe MTT-Lösung überführt und 3 Stunden lang inkubiert.
Das resultierende violettblaue Formazansalz, das hauptsächlich durch den mitochondrialen Stoffwechsel entsteht, wird 2 Stunden lang mit Isopropanol extrahiert. Die optische Dichte des extrahierten Formazans wird mit einem Spektrophotometer bestimmt. Eine Chemikalie wird als reizend eingestuft, wenn die Gewebelebensfähigkeit im Vergleich zu Geweben, die mit einer Negativkontrolle behandelt wurden, unter 50 Prozent fällt. Dieses Verfahren kann als vollständiger Ersatz für den In-vivo-Hautreiztest an Kaninchen zur Gefahrenidentifizierung und Kennzeichnung von Chemikalien gemäß den Vorschriften der Europäischen Union verwendet werden.
Neben den zahlreichen Test-, Mess-, Analyse- und Bewertungsstudien, die es für Unternehmen in verschiedenen Branchen anbietet, bietet unsere Organisation mit geschultem und fachkundigem Personal und fortschrittlicher technologischer Ausrüstung auch Testdienstleistungen gemäß der Norm „EPI-200-SIT Hautreizungstest“ an .
Um einen Termin zu vereinbaren, genauere Informationen zu erhalten oder eine Bewertung anzufordern, können Sie uns bitten, unser Formular auszufüllen und Sie zu erreichen.
