OCDE TG 439 Irritação cutânea in vitro: método de teste de epiderme humana reconstruída

A norma “OECD TG 439 Irritação cutânea in vitro: Método de teste da epiderme humana reconstituída”, publicada no âmbito das diretrizes da OCDE sobre conduta empresarial responsável para empresas multinacionais (diretrizes da OCDE) , descreve um método de teste in vitro utilizado para a identificação de perigos de substâncias químicas irritantes (substâncias e misturas) de acordo com a Categoria 2 do Sistema Global Harmonizado de Classificação e Rotulagem (GHS) da ONU.

Este método é baseado na epiderme humana reconstruída (RhE), que em seu design geral imita de perto as propriedades bioquímicas e fisiológicas das partes superiores da pele humana. A viabilidade celular é medida pela conversão enzimática do corante vital MTT no sal azul de formazan, que é medido quantitativamente após a extração dos tecidos. As substâncias de teste irritantes são definidas pela sua capacidade de reduzir a viabilidade celular abaixo dos limites definidos (igual a 2 por cento ou menos para a categoria 50). Produtos químicos coloridos também podem ser testados usando um procedimento HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência).

Existem três métodos de teste validados que cumprem a norma OCDE TG 439. Dependendo do quadro regulamentar e do sistema de classificação utilizados, este procedimento pode ser utilizado para determinar a irritação cutânea das substâncias em estudo como um teste substituto autónomo para testes de irritação cutânea in vivo ou como um teste substituto parcial no âmbito de uma estratégia de testes escalonados.

Em princípio, o produto químico em estudo é aplicado topicamente num modelo tridimensional de RhE (epiderme humana reconstruída), constituído por queratinócitos epidérmicos de origem humana, cultivados e não transformados, para criar um modelo multicamadas e altamente diferenciado da epiderme humana. Consiste em camadas basais, espinhosas e granulares regulares e um estrato córneo multicamadas contendo camadas lipídicas lamelares intercelulares representando as principais classes lipídicas semelhantes às encontradas in vivo.

A irritação cutânea induzida por produtos químicos manifesta-se principalmente por eritema e edema e é o resultado de uma cascata de eventos que começa quando os produtos químicos passam através do estrato córneo e danificam as camadas inferiores dos queratinócitos e outras células da pele.

As células danificadas podem liberar mediadores inflamatórios ou iniciar uma cascata inflamatória que também atua nas células da derme, especialmente nas células estromais e endoteliais dos vasos sanguíneos. É a expansão e o aumento da permeabilidade das células endoteliais que produzem o eritema e o edema observados. Em particular, os métodos de ensaio baseados em RhE medem eventos iniciais na cascata, tais como danos celulares ou teciduais, utilizando a viabilidade celular como leitura quando não há vascularização no sistema de ensaio in vitro.

No modelo RhE, a viabilidade celular é medida pela conversão enzimática do corante vital MTT no sal azul de formazan, que é medido quantitativamente após a remoção dos tecidos (o MTT é usado para avaliar a viabilidade celular em função do potencial redox). Os produtos químicos irritantes são definidos pela sua capacidade de reduzir a viabilidade celular abaixo dos níveis limiares definidos (ou seja, pelo menos 2 por cento para a categoria 50). Dependendo do quadro regulamentar e da aplicabilidade deste método de teste, os produtos químicos de teste que produzem viabilidade celular acima de um nível limite definido podem ser considerados não irritantes (ou seja, sem categoria, pelo menos 50 por cento).

Queratinócitos humanos não transformados devem ser usados ​​para reconstruir o epitélio. Sob um estrato córneo funcional, deve haver muitas camadas de células epiteliais vivas (camada basal, estrato espinhoso, estrato granuloso). O estrato córneo deve ser multicamadas, contendo o perfil lipídico essencial para formar uma barreira funcional com resistência para resistir à rápida penetração de produtos químicos de referência citotóxicos, por exemplo, dodeacil sulfato de sódio.

A função da barreira deve ser demonstrada e pode ser avaliada pela determinação da concentração na qual um produto químico de referência reduz a viabilidade do tecido em 50% após um tempo de exposição fixo, ou pela determinação do tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade celular em 50% após a aplicação do produto químico de referência. em uma concentração especificada e fixa. As propriedades de retenção do modelo RhE (epiderme humana reconstruída) devem evitar que o material ao redor do estrato córneo migre para o tecido vivo, resultando em uma modelagem deficiente da exposição da pele. O modelo RHE deve estar livre de contaminação bacteriana, viral, micoplasmática ou fúngica.

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