OECD TG 488 Análises de mutações genéticas em células somáticas e germinativas de roedores transgênicos

As diretrizes da OCDE para conduta empresarial responsável para empresas multinacionais (OECD TG 488 “Ensaios de mutação genética em células somáticas e germinativas de roedores transgênicos”) descrevem um método de teste in vivo usado para detectar substâncias químicas que causam mutações genéticas em células somáticas e germinativas de roedores transgênicos. Esta norma faz parte das “Diretrizes da OCDE sobre testes de substâncias químicas, Parte 4: Efeitos na saúde” e aborda uma lacuna significativa nos testes de genotoxicidade: a medição direta de mutações genéticas in vivo em diversos tecidos.

Ao contrário de muitos testes in vivo que se concentram em danos cromossômicos ou quebras de fita de DNA, o padrão TG 488 mede especificamente mutações genéticas (mutações pontuais, pequenas inserções/deleções, alterações de fase de leitura). Este padrão é particularmente valioso para o acompanhamento de resultados positivos de mutagenicidade in vitro, para a investigação de mecanismos de carcinogenicidade ou para a avaliação de riscos hereditários decorrentes de mutações em células germinativas.

Este método geralmente segue estes passos:

• Os animais são tratados com a substância química em teste (por qualquer via, incluindo oral, dérmica, inalatória ou por implantação) durante um período de aplicação definido (geralmente 28 dias).
• Isso é seguido por um período de sintomas/fixação (o tempo necessário para que as lesões no DNA se tornem mutações fixas varia dependendo do tecido e do tipo de célula).
• Os animais são submetidos à eutanásia, os tecidos são coletados e congelados.
• O DNA genômico é extraído dos tecidos alvo.
• Os transgenes são empacotados em vetores de fago e transferidos para bactérias.
• As mutações são detectadas por meio de alterações fenotípicas (por exemplo, sistemas de seleção positiva para seleção de cores ou deleções).
• A frequência de mutações é calculada dividindo-se o número de placas/colônias mutantes pelo número total obtido (normalmente buscando 10^5–10^6 placas por tecido por animal).

Este método de teste detecta uma ampla gama de mutações e leva em consideração fatores in vivo, como metabolismo, farmacocinética e reparo do DNA.

Os elementos de projeto do estudo são os seguintes:

• Dosagem: Para garantir a consistência com estudos de toxicidade de dose repetida, integração e para reduzir o número de animais, geralmente é utilizado por 28 dias consecutivos.
• Tempo de amostragem: Depende do tecido e da finalidade (mais curto para células de divisão rápida, mais longo para células germinativas ou fixação).
• Verificações: Verificações simultâneas de resultados negativos/de portadores, verificações de resultados positivos e consideração de dados históricos de verificações.
• Avaliação: Decisões positivas/negativas consideram a significância estatística, a relação dose-resposta e a significância biológica (comparação com dados históricos de controle). A análise molecular de mutantes pode fornecer espectros de mutação.
• Potencial de integração: Pode ser combinado com outros parâmetros de avaliação, como o ensaio de micronúcleo (TG 474) ou o ensaio de mutação α suína nos mesmos animais.

Os pontos fortes desta norma são os seguintes:

• Ele mede mutações genéticas (e não apenas marcadores) em praticamente todos os tecidos.
• Envolve todo o metabolismo e processo de reparação do animal.
• Ele oferece suporte tanto à identificação de perigos quanto à análise do mecanismo de ação.
• É flexível tanto para avaliação de células somáticas quanto de células germinativas.

As limitações desta norma são as seguintes:

• Isso requer animais transgênicos especializados e conhecimento técnico (como o empacotamento de fagos).
• O banco de dados de células germinativas ainda é relativamente limitado em comparação com os bancos de dados de tecidos somáticos.
• A substância de teste ou seus metabólitos são inadequados se não atingirem o tecido alvo.

A norma OECD TG 488 é utilizada em avaliações de segurança química (por exemplo, REACH e EPA na Europa) para substâncias que apresentam potencial mutagênico in vitro ou que levantam preocupações sobre riscos hereditários. Isso auxilia em abordagens baseadas em evidências ponderadas para classificação e rotulagem (por exemplo, mutagênicos de células germinativas).

O trabalho em andamento inclui a otimização dos tempos de amostragem de células germinativas, o aprimoramento das abordagens estatísticas com controles históricos e uma maior integração com outros testes para minimizar o uso de animais.

Esta diretriz é uma ferramenta robusta e internacionalmente consistente para promover a toxicologia genética e proteger a saúde humana contra riscos mutagênicos.

Em resumo, a norma OECD TG 488 inclui um método de teste internacionalmente aceito para avaliar se uma substância química causa mutações genéticas em um organismo vivo (in vivo). Este teste é amplamente utilizado em toxicologia genética, avaliação de risco regulatório e, quando aplicável, avaliação de segurança química para produtos farmacêuticos, produtos químicos industriais, pesticidas, aditivos alimentares e ingredientes cosméticos.

O objetivo principal desta norma é determinar se a exposição a uma substância causa o seguinte:

• Mutações em células somáticas (mutações em células do corpo que estão potencialmente ligadas ao desenvolvimento do câncer)
• Mutações em células germinativas (mutações em células precursoras de espermatozoides ou óvulos, potencialmente hereditárias)
• Esta norma avalia eventos de mutação em todo o sistema animal e abrange: metabolismo, absorção e distribuição, reparo do DNA e respostas específicas de cada tecido.

Isso torna o método extremamente valioso, especialmente quando os resultados in vitro são positivos ou inconclusivos e os órgãos reguladores precisam de validação em um modelo in vivo biologicamente relevante.

Os roedores transgênicos usados ​​nos testes contêm genes repórteres reversíveis. Esses genes são integrados ao genoma do animal. Este método mede principalmente o seguinte:

• Frequência de mutações
• Espectro de mutações (análise de sequenciamento sob demanda)
• Resposta mutagênica específica do tecido

Um aumento estatisticamente significativo na frequência de mutantes em comparação com os controles indica atividade mutagênica.

A Diretriz de Orientação 488 da OCDE (TG 488) preenche uma importante lacuna regulatória, pois muitos mutagénicos comportam-se de maneira diferente em sistemas vivos do que em culturas de células. As principais razões para a sua necessidade são as seguintes:

• Isso confirma se os resultados de mutagenicidade in vitro são biologicamente significativos in vivo.
• Detecta mutagenicidade específica de tecido.
• Avalia compostos metabolicamente ativados.
• Auxilia na avaliação da carcinogenicidade.
• Isso ajuda a avaliar o risco de mutações hereditárias.

Os órgãos reguladores normalmente utilizam a norma TG 488 nas seguintes situações:

• Quando o teste de mutação genética in vitro for positivo
• Quando há preocupação com mecanismos reativos de DNA
• Quando são necessários testes de acompanhamento adicionais em uma estratégia integrada de genotoxicidade.

Em conclusão, a norma OECD TG 488 é um teste de mutagenicidade in vivo de grande importância, que permite a detecção direta de mutações genéticas em roedores transgênicos. Ela oferece maior biocompatibilidade do que muitos métodos in vitro e é particularmente útil em processos de tomada de decisão regulatória na avaliação do potencial genotóxico e carcinogênico de substâncias químicas.

Há muitos anos, nossa organização, com sua equipe competente e experiente, compreende as necessidades de seus clientes, fornecendo os serviços avançados de testes que eles exigem e auxiliando-os no estabelecimento, implementação e aprimoramento de sistemas de gestão. Nesse contexto, também oferecemos serviços de testes em conformidade com a norma OECD TG 488.