OECD TG 439 Podrażnienie skóry in vitro: metoda badania zrekonstruowanego ludzkiego naskórka

Norma „OECD TG 439 Badanie drażnienia skóry in vitro: Metoda badania z wykorzystaniem odtworzonego naskórka ludzkiego”, opublikowana zgodnie z wytycznymi OECD w sprawie odpowiedzialnego prowadzenia działalności przez przedsiębiorstwa wielonarodowe (wytyczne OECD) , opisuje metodę badania in vitro stosowaną do identyfikacji zagrożeń stwarzanych przez substancje chemiczne o działaniu drażniącym (substancje i mieszaniny) zgodnie z kategorią 2 Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania ONZ (GHS).

Metoda ta opiera się na zrekonstruowanym ludzkim naskórku (RhE), który w swojej ogólnej konstrukcji bardzo naśladuje właściwości biochemiczne i fizjologiczne górnych partii ludzkiej skóry. Żywotność komórek mierzy się poprzez enzymatyczną konwersję barwnika życiowego MTT do niebieskiej soli formazanu, którą mierzy się ilościowo po ekstrakcji z tkanek. Drażniące substancje testowe definiuje się na podstawie ich zdolności do zmniejszania żywotności komórek poniżej określonych poziomów progowych (równych 2 procent lub mniej dla kategorii 50). Kolorowe substancje chemiczne można również badać za pomocą procedury HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa).

Istnieją trzy zwalidowane metody badawcze, które są zgodne z normą OECD TG 439. W zależności od ram regulacyjnych i zastosowanego systemu klasyfikacji, procedurę tę można zastosować do określenia działania drażniącego na skórę badanymi substancjami, jako samodzielny test zastępczy do badania działania drażniącego na skórę in vivo lub jako częściowy test zastępczy w ramach wielopoziomowej strategii badawczej.

Zasadniczo badaną substancję chemiczną nakłada się miejscowo na trójwymiarowy model RhE (zrekonstruowany ludzki naskórek), składający się z hodowanych, nieprzekształconych keratynocytów naskórka pochodzących od człowieka, w celu stworzenia wielowarstwowego, wysoce zróżnicowanego modelu ludzkiego naskórka. Składa się z regularnych warstw podstawnych, kolczastych i ziarnistych oraz wielowarstwowej warstwy rogowej zawierającej międzykomórkowe lamelarne warstwy lipidowe reprezentujące główne klasy lipidów podobne do tych występujących in vivo.

Podrażnienie skóry wywołane substancjami chemicznymi objawia się przede wszystkim rumieniem i obrzękiem i jest wynikiem kaskady zdarzeń, która rozpoczyna się w momencie przedostania się substancji chemicznych przez warstwę rogową naskórka i uszkodzenia dolnych warstw keratynocytów oraz innych komórek skóry.

Uszkodzone komórki mogą uwalniać mediatory stanu zapalnego lub inicjować kaskadę zapalną, która działa również na komórki skóry właściwej, zwłaszcza komórki zrębowe i śródbłonkowe naczyń krwionośnych. To właśnie ekspansja i zwiększona przepuszczalność komórek śródbłonka powoduje obserwowany rumień i obrzęk. W szczególności metody testowe oparte na RhE mierzą zdarzenia inicjujące w kaskadzie, takie jak uszkodzenie komórek lub tkanek, wykorzystując żywotność komórek jako odczyt, gdy w systemie testu in vitro nie ma unaczynienia.

W modelu RhE żywotność komórek mierzy się poprzez enzymatyczną konwersję barwnika życiowego MTT do niebieskiej soli formazanu, którą mierzy się ilościowo po usunięciu z tkanek (MTT służy do oceny żywotności komórek jako funkcji potencjału redoks). Drażniące substancje chemiczne definiuje się na podstawie ich zdolności do zmniejszania żywotności komórek poniżej określonych poziomów progowych (tj. co najmniej 2 procent dla kategorii 50). W zależności od ram regulacyjnych i możliwości zastosowania tej metody badawczej badane substancje chemiczne, które powodują żywotność komórek powyżej określonego poziomu progowego, można uznać za niedrażniące (tj. brak kategorii, co najmniej 50 procent).

Do rekonstrukcji nabłonka należy użyć nieprzekształconych ludzkich keratynocytów. Pod funkcjonalną warstwą rogową naskórka musi znajdować się wiele warstw żywych komórek nabłonkowych (warstwa podstawna, warstwa kolczysta, warstwa ziarnista). Warstwa rogowa naskórka musi być wielowarstwowa i zawierać niezbędny profil lipidowy, tworząc funkcjonalną barierę o wytrzymałości zapobiegającej szybkiej penetracji cytotoksycznych substancji chemicznych odniesienia, np. dodeacylosiarczanu sodu.

Należy wykazać funkcję bariery i można ją ocenić poprzez określenie stężenia, przy którym substancja chemiczna odniesienia zmniejsza żywotność tkanek o 50 procent po ustalonym czasie ekspozycji, lub poprzez określenie czasu ekspozycji wymaganego do zmniejszenia żywotności komórek o 50 procent po zastosowaniu substancji chemicznej odniesienia w określonym, stałym stężeniu. Właściwości retencyjne modelu RhE (zrekonstruowanego ludzkiego naskórka) powinny zapobiegać migracji materiału wokół warstwy rogowej naskórka do żywej tkanki, co skutkuje słabym modelowaniem ekspozycji skóry. Model RhE musi być wolny od zanieczyszczeń bakteryjnych, wirusowych, mykoplazmowych i grzybiczych.

Wśród licznych badań, pomiarów, analiz i ewaluacji, które nasza organizacja świadczy dla przedsiębiorstw z różnych sektorów, dysponując przeszkolonym i specjalistycznym personelem oraz zaawansowanym sprzętem technologicznym, świadczymy również usługi testowe określone w „OECD TG 439 Podrażnienie skóry in vitro: rekonstrukcje ludzkie metoda badania naskórka” daje standard.