OECD TG 488 Analizy mutacji genów komórek somatycznych i rozrodczych gryzoni transgenicznych

Wytyczne OECD dotyczące odpowiedzialnego postępowania biznesowego dla korporacji międzynarodowych (OECD TG 488 „Testy mutacji genów komórek somatycznych i rozrodczych gryzoni transgenicznych”) opisują metodę badań in vivo stosowaną do wykrywania substancji chemicznych powodujących mutacje genów w komórkach somatycznych i rozrodczych gryzoni transgenicznych. Norma ta jest częścią „Wytycznych OECD dotyczących badań substancji chemicznych, Część 4: Skutki zdrowotne” i eliminuje istotną lukę w badaniach genotoksyczności: bezpośredni pomiar mutacji genów in vivo w różnych tkankach.

W przeciwieństwie do wielu testów in vivo, które koncentrują się na uszkodzeniach chromosomów lub pęknięciach nici DNA, standard TG 488 mierzy mutacje genów (mutacje punktowe, małe insercje/delecje, przesunięcia ramki odczytu). Standard ten jest szczególnie cenny w monitorowaniu pozytywnych wyników mutagenności in vitro, badaniu mechanizmów rakotwórczości lub ocenie ryzyka dziedzicznego wynikającego z mutacji komórek rozrodczych.

Metoda ta zazwyczaj przebiega następująco:

• Zwierzętom podaje się substancję badaną (dowolną drogą, w tym doustnie, przez skórę, przez inhalację lub implantację) przez określony okres stosowania (zwykle 28 dni).
• Następnie następuje okres objawów/fiksacji (czas, jaki jest potrzebny, aby zmiany DNA stały się utrwalonymi mutacjami, różni się w zależności od tkanki i rodzaju komórki).
• Zwierzęta są uśmiercane, tkanki są pobierane i zamrażane.
• Genomowe DNA ekstrahuje się z tkanek docelowych.
• Transgeny umieszczane są w wektorach fagowych i przenoszone do bakterii.
• Mutacje wykrywa się poprzez zmiany fenotypowe (np. pozytywne systemy selekcji w zakresie doboru koloru lub delecji).
• Częstotliwość występowania mutacji oblicza się, dzieląc liczbę płytek/koloni zmutowanych przez całkowitą liczbę uzyskanych płytek (zwykle docelowo 105–106 płytek na tkankę na zwierzę).

Ta metoda testowa pozwala wykryć szeroki zakres mutacji i bierze pod uwagę czynniki in vivo, takie jak metabolizm, farmakokinetyka i naprawa DNA.

Elementy projektu badania są następujące:

• Dawkowanie: Aby zapewnić spójność z badaniami toksyczności dawek wielokrotnych, ich integrację i ograniczyć liczbę zwierząt, dawkę stosuje się zazwyczaj przez 28 kolejnych dni.
• Czas pobierania próbek: Zależą one od tkanki i celu (krótszy w przypadku komórek szybko dzielących się, dłuższy w przypadku komórek rozrodczych lub utrwalania).
• Kontrole: Jednoczesne kontrole negatywne/nośnikowe, kontrole pozytywne oraz uwzględnienie historycznych danych kontrolnych.
• Ocena: Decyzje pozytywne/negatywne uwzględniają istotność statystyczną, zależność dawka-odpowiedź oraz istotność biologiczną (porównanie z historycznymi danymi kontrolnymi). Analiza molekularna mutantów może dostarczyć widm mutacji.
• Potencjał integracyjny: Możliwość łączenia z innymi punktami końcowymi, takimi jak mikrojądro (TG 474) lub badanie mutacji α u świń u tych samych zwierząt.

Mocne strony tej normy są następujące:

• Mierzy mutacje genów (nie tylko markery) w niemal każdej tkance.
• Dotyczy całego procesu metabolizmu i naprawy organizmu.
• Wspomaga identyfikację zagrożeń i analizę mechanizmów działania.
• Jest on elastyczny w ocenie zarówno komórek somatycznych, jak i rozrodczych.

Ograniczenia tej normy są następujące:

• Wymaga to specjalistycznych zwierząt transgenicznych i wiedzy technicznej (takiej jak pakowanie fagów).
• Baza danych komórek rozrodczych jest wciąż stosunkowo ograniczona w porównaniu do baz danych tkanek somatycznych.
• Substancja badana lub jej metabolity są nieodpowiednie, jeżeli nie dotrą do tkanki docelowej.

Norma OECD TG 488 jest stosowana w ocenach bezpieczeństwa chemicznego (np. w rozporządzeniu REACH i EPA w Europie) w odniesieniu do substancji wykazujących potencjał mutagenny in vitro lub budzących obawy dotyczące ryzyka dziedzicznego. Pomaga to w stosowaniu podejścia opartego na dowodach wagowych do klasyfikacji i oznakowania (np. mutagenów komórek rozrodczych).

Trwające prace obejmują optymalizację czasu pobierania próbek komórek rozrodczych, udoskonalanie metod statystycznych przy użyciu kontroli historycznych oraz lepszą integrację z innymi testami w celu ograniczenia wykorzystywania zwierząt.

Niniejsze wytyczne stanowią solidne, spójne w skali międzynarodowej narzędzie służące rozwojowi toksykologii genetycznej i ochronie zdrowia ludzkiego przed zagrożeniami mutagennymi.

Krótko mówiąc, norma OECD TG 488 zawiera uznaną na całym świecie metodę badawczą służącą do oceny, czy substancja chemiczna powoduje mutacje genów w żywym organizmie (in vivo). Test ten jest szeroko stosowany w toksykologii genetycznej, ocenie ryzyka regulacyjnego oraz, w stosownych przypadkach, w ocenie bezpieczeństwa chemicznego produktów farmaceutycznych, chemikaliów przemysłowych, pestycydów, dodatków do żywności i składników kosmetyków.

Głównym celem niniejszej normy jest ustalenie, czy narażenie na daną substancję powoduje następujące skutki:

• Mutacje komórek somatycznych (mutacje w komórkach ciała potencjalnie powiązane z rozwojem raka)
• Mutacje komórek rozrodczych (mutacje w komórkach prekursorowych plemników lub komórek jajowych, potencjalnie dziedziczne)
• Norma ta ocenia zdarzenia mutacji w całym organizmie zwierzęcym i obejmuje: metabolizm, wchłanianie i dystrybucję, naprawę DNA oraz reakcje specyficzne dla tkanek.

To sprawia, że ​​jest to niezwykle cenne, zwłaszcza gdy wyniki badań in vitro są pozytywne lub niejednoznaczne, a organy regulacyjne potrzebują walidacji w biologicznie istotnym modelu in vivo.

Gryzonie transgeniczne użyte w testach zawierają odwracalne geny reporterowe. Geny te są zintegrowane z genomem zwierzęcia. Ta metoda mierzy przede wszystkim:

• Częstotliwość mutacji
• Widmo mutacji (analiza sekwencjonowania na żądanie)
• Odpowiedź mutagenna specyficzna dla tkanki

Statystycznie istotny wzrost częstości występowania mutacji w porównaniu do grupy kontrolnej wskazuje na aktywność mutagenną.

Wytyczna OECD TG 488 wypełnia istotną lukę regulacyjną, ponieważ wiele mutagenów zachowuje się inaczej w organizmach żywych niż w hodowlach komórkowych. Główne powody jej konieczności to:

• Potwierdza to, czy wyniki badań mutagenności in vitro mają znaczenie biologiczne in vivo.
• Wykrywa mutagenność tkankowo-specyficzną.
• Ocenia związki aktywowane metabolicznie.
• Wspomaga ocenę rakotwórczości.
• Pomaga ocenić ryzyko wystąpienia mutacji dziedzicznych.

Organy regulacyjne zazwyczaj stosują normę TG 488 w następujących sytuacjach:

• Gdy test mutacji genu in vitro jest pozytywny
• Gdy istnieje obawa o mechanizmy reaktywności DNA
• Gdy w ramach zintegrowanej strategii genotoksyczności konieczne są dodatkowe badania kontrolne

Podsumowując, norma OECD TG 488 to niezwykle ważny test mutagenności in vivo, który umożliwia bezpośrednie wykrywanie mutacji genów u gryzoni transgenicznych. Zapewnia ona lepszą biozgodność niż wiele metod in vitro i jest szczególnie użyteczna w procesach decyzyjnych przy ocenie potencjału genotoksycznego i rakotwórczego substancji chemicznych.

Nasza organizacja, dysponująca kompetentną i doświadczoną kadrą, od wielu lat rozumie potrzeby swoich klientów, zapewniając im zaawansowane usługi testowe, których potrzebują, oraz wspierając ich we wdrażaniu, wdrażaniu i doskonaleniu systemów zarządzania. W tym zakresie świadczymy również usługi testowe zgodne z normą OECD TG 488.