La norma “OECD TG 435 Método de prueba de barrera de membrana in vitro para irritación de la piel” publicada bajo las directrices de la OCDE sobre conducta empresarial responsable para empresas multinacionales (directrices de la OCDE) describe un método de prueba de barrera de membrana in vitro utilizado para identificar productos químicos corrosivos. Este método de prueba utiliza una membrana artificial diseñada para reaccionar a químicos corrosivos de manera similar a la piel de un animal.
El método de prueba de barrera de membrana in vitro se puede utilizar para probar sólidos, líquidos y emulsiones. Sin embargo, las sustancias acuosas con valores de pH en el rango de 4,5 a 8,5 generalmente no son adecuadas para realizar pruebas.
El método de prueba descrito permite la identificación de mezclas y productos químicos corrosivos y la subcategorización de sustancias corrosivas según lo permitido en el sistema globalmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos. Esta clasificación se basa en el tiempo de penetración de la sustancia a través de la barrera de membrana.
Este sistema de prueba consta de dos componentes:
Al aplicar este sistema de prueba, se prepara un número apropiado de réplicas para cada sustancia de prueba y sus controles correspondientes. Se registran y escalonan los tiempos de aplicación de la sustancia problema a la barrera de membrana. El tiempo (en minutos) entre la aplicación de la sustancia problema a la barrera de membrana y la penetración de la barrera se utiliza para determinar la corrosividad de la sustancia problema.
La corrosividad de la piel se ha determinado tradicionalmente aplicando la sustancia problema a la piel de animales vivos y evaluando el grado de daño tisular después de un período de tiempo específico. Además de la norma OCDE TG 435, se han adoptado otros métodos de prueba in vitro como alternativas al procedimiento estándar in vivo con piel de conejo (OCDE TG 404) utilizado para identificar sustancias químicas corrosivas. Las directrices de la OCDE recomiendan el uso de métodos de prueba in vitro validados y aceptados.
En este enfoque modular, los resultados positivos de los métodos de prueba in vitro se utilizan para clasificar una sustancia química como corrosiva sin necesidad de realizar pruebas con animales. De esta forma, se pretende prevenir el uso de animales en ensayos y prevenir el dolor y la angustia que pueden surgir si se utilizan animales para este fin.
Este método de prueba detecta daños en la barrera de la membrana causados por sustancias problema corrosivas tras la aplicación de la sustancia problema a la superficie de la barrera de membrana macromolecular sintética mediante un “sistema de detección de sustancias químicas”, posiblemente mediante los mismos mecanismos de irritación que operan en la piel viva.
La penetración o rotura de la barrera de la membrana se puede medir mediante varios procedimientos o sistemas de detección química, incluido el cambio en el color del tinte indicador de pH u otra propiedad de la solución indicadora debajo de la barrera.
Se debe determinar que la barrera de membrana sea válida para el uso previsto, es decir, relevante y confiable. Esto incluye garantizar que las diferentes preparaciones sean consistentes en términos de sus propiedades de barrera, como por ejemplo ser capaces de mantener una barrera contra productos químicos no corrosivos, ser capaces de categorizar las propiedades corrosivas de los productos químicos entre las subcategorías de corrosividad del sistema globalmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos. La clasificación asignada se basa en el tiempo que tarda una sustancia química en cruzar la barrera de la membrana y penetrar la solución indicadora.
Antes del uso rutinario del método de prueba de barrera de membrana in vitro, los laboratorios deben cumplir con esta norma y demostrar su competencia técnica clasificando correctamente las sustancias de calificación propuestas. Cuando una sustancia de la lista no esté disponible o no esté justificada, se podrá utilizar otra sustancia para la que se disponga de suficientes datos de referencia in vivo e in vitro.
Las pruebas deben realizarse a temperatura ambiente (rango 17-25 grados) y los componentes deben cumplir con las condiciones especificadas en la norma.
Antes de realizar la prueba de barrera de membrana, se realiza una prueba de compatibilidad química para determinar si el sistema de detección de sustancias químicas puede detectar la sustancia problema. Si el sistema de detección de sustancias químicas no detecta la sustancia problema, el método de prueba de barrera de membrana no es adecuado para evaluar la corrosividad potencial de esa sustancia problema y se debe utilizar un método de prueba diferente. El sistema de detección de sustancias químicas y las condiciones de exposición utilizadas para las pruebas de compatibilidad deben reflejar la exposición en pruebas de barrera de membrana posteriores.
Si es adecuado para el método de prueba, una sustancia problema calificada mediante pruebas de compatibilidad debe someterse a una prueba de categoría de escala de tiempo, que es una prueba de detección para distinguir entre ácidos o bases débiles y fuertes. Por ejemplo, en el método de prueba de referencia validado, se utiliza una prueba de categorización de escala de tiempo para indicar qué dos escalas de tiempo deben usarse dependiendo de si se detectan reservas ácidas o alcalinas significativas. Dependiendo de la reserva ácida o alcalina de la sustancia problema, deben utilizarse dos escalas de tiempo de penetración diferentes para determinar la corrosividad y el sistema armonizado a nivel mundial para la clasificación y el etiquetado de las sustancias químicas en la subcategoría de corrosividad cutánea.
La barrera de membrana consta de dos componentes: un gel acuoso macromolecular proteico y una membrana de soporte permeable. El gel proteico debe ser impermeable a líquidos y sólidos, pero puede erosionarse y hacerse permeable. La barrera de membrana completamente construida debe almacenarse en condiciones predeterminadas que se haya demostrado que previenen la degradación del gel, como desecación, crecimiento microbiano, cizallamiento o agrietamiento, que degradarían su rendimiento. Se debe determinar el período de almacenamiento aceptable y no se deben utilizar preparaciones de barrera de membrana después de este período. La membrana de soporte permeable proporciona soporte mecánico al gel proteico durante el proceso de gelificación y la exposición a la sustancia problema. La membrana de soporte debe impedir que el gel se hunda o se desplace y debe ser fácilmente permeable a todas las sustancias problema.
En términos del sistema de detección de sustancias químicas, la solución indicadora, que es la misma solución utilizada para las pruebas de compatibilidad, debe responder a la presencia de una sustancia química de prueba. Se debe utilizar un tinte indicador de pH o una combinación de tintes, como rojo cresol y naranja de metilo, que mostrarán un cambio de color en respuesta a la presencia del producto problema.
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