La norma “OECD TG 439 Irritación cutánea in vitro: Método de ensayo con epidermis humana reconstituida”, publicada en el marco de las directrices de la OCDE sobre conducta empresarial responsable para empresas multinacionales (directrices de la OCDE) , describe un método de ensayo in vitro utilizado para la identificación de riesgos de sustancias químicas irritantes (sustancias y mezclas) de conformidad con la Categoría 2 del Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado (SGA) de las Naciones Unidas.
Este método se basa en la epidermis humana reconstruida (RhE), que en su diseño general imita fielmente las propiedades bioquímicas y fisiológicas de las partes superiores de la piel humana. La viabilidad celular se mide mediante la conversión enzimática del tinte vital MTT en sal azul de formazán, que se mide cuantitativamente después de la extracción de los tejidos. Las sustancias de prueba irritantes se definen por su capacidad para reducir la viabilidad celular por debajo de niveles umbral definidos (igual al 2 por ciento o menos para la categoría 50). Los productos químicos coloreados también se pueden probar mediante un procedimiento de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento).
Existen tres métodos de prueba validados que cumplen con la norma OCDE TG 439. Dependiendo del marco regulatorio y el sistema de clasificación utilizados, este procedimiento puede usarse para determinar la irritación cutánea de las sustancias de prueba como una prueba sustituta independiente para las pruebas de irritación cutánea in vivo o como una prueba sustituta parcial dentro de una estrategia de prueba escalonada.
En principio, la sustancia problema se aplica tópicamente a un modelo tridimensional de RhE (epidermis humana reconstruida) que consta de queratinocitos epidérmicos de origen humano cultivados y no transformados para crear un modelo multicapa altamente diferenciado de la epidermis humana. Consiste en capas basales, espinosas y granulares regulares y un estrato córneo multicapa que contiene capas lipídicas laminares intercelulares que representan clases principales de lípidos similares a las que se encuentran in vivo.
La irritación de la piel inducida por sustancias químicas se manifiesta principalmente por eritema y edema y es el resultado de una cascada de eventos que comienza cuando las sustancias químicas atraviesan el estrato córneo y dañan las capas inferiores de queratinocitos y otras células de la piel.
Las células dañadas pueden liberar mediadores inflamatorios o iniciar una cascada inflamatoria que también actúa sobre las células de la dermis, especialmente las células estromales y endoteliales de los vasos sanguíneos. Es la expansión y el aumento de la permeabilidad de las células endoteliales lo que produce el eritema y el edema observados. En particular, los métodos de ensayo basados en RhE miden los eventos iniciadores en la cascada, como el daño celular o tisular, utilizando la viabilidad celular como lectura en ausencia de vascularización en el sistema de ensayo in vitro.
En el modelo RhE, la viabilidad celular se mide mediante la conversión enzimática del colorante vital MTT en la sal azul de formazán, que se mide cuantitativamente después de su eliminación de los tejidos (el MTT se utiliza para evaluar la viabilidad celular en función del potencial redox). Las sustancias químicas irritantes se definen por su capacidad para reducir la viabilidad celular por debajo de niveles umbral definidos (es decir, al menos el 2 por ciento para la categoría 50). Dependiendo del marco regulatorio y la aplicabilidad de este método de prueba, los químicos de prueba que producen viabilidad celular por encima de un nivel umbral definido pueden considerarse no irritantes (es decir, ninguna categoría, al menos 50 por ciento).
Se deben utilizar queratinocitos humanos no transformados para reconstruir el epitelio. Debajo de un estrato córneo funcional debe haber muchas capas de células epiteliales vivas (capa basal, estrato espinoso, estrato granuloso). El estrato córneo debe tener varias capas y contener el perfil lipídico esencial para formar una barrera funcional con la dureza necesaria para resistir la rápida penetración de productos químicos citotóxicos de referencia, por ejemplo, dodeacilsulfato de sodio.
La función de barrera debe demostrarse y puede evaluarse determinando la concentración a la cual una sustancia química de referencia reduce la viabilidad del tejido en un 50 por ciento después de un tiempo de exposición fijo, o determinando el tiempo de exposición requerido para reducir la viabilidad celular en un 50 por ciento tras la aplicación de la sustancia química de referencia. a una concentración fija y especificada. Las propiedades de retención del modelo RhE (epidermis humana reconstruida) deberían evitar que el material alrededor del estrato córneo migre al tejido vivo, lo que da como resultado un modelado deficiente de la exposición de la piel. El modelo RhE debe estar libre de contaminación bacteriana, viral, micoplasma o fúngica.
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