Для тестов на биосовместимость, требующих тестирования на генотоксичность, мы предлагаем несколько типов тестов, включая мутагенность Эймса, хромосомную аберрацию, лимфому мыши и микронуклеус мыши, в зависимости от типа вашего продукта и требований к данным. Эти тесты соответствуют рекомендациям OECD и ISO как один из трех уровней тестов in vitro на генотоксичность.
Тест Эймса на мутагенность используется для определения потенциальной мутагенной активности экстракта из медицинского устройства / материала. Тест на обратную бактериальную мутацию (тест Эймса) проводится как часть набора тестов на генотоксичность, чтобы определить, являются ли утечки из медицинского устройства / материала мутагенными.
Тест на хромосомную аберрацию используется для сканирования медицинских устройств / расходных материалов, чтобы определить, вызывают ли они структурные хромосомные аномалии в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Тест проводится на устройствах / материалах с постоянным контактом с пациентом, продолжительным контактом с пациентом или контактом с кровью. Тест на хромосомную аберрацию соответствует рекомендациям OECD и ISO как один из трех уровней тестирования in vitro на генотоксичность.
При тестировании на лимфому мышей часто используются культуры клеток млекопитающих для выявления генных мутаций, изменения структуры и числа хромосом и других токсических эффектов генов, вызванных медицинскими устройствами, материалами или экстрактами. Эти тесты используются, чтобы гарантировать, что устройства, которые находятся в длительном контакте с телом, не выявляют генотоксичность, которая может привести к генным мутациям с потенциалом рака.
Анализ Mouse Micronucleus используется для оценки способности медицинского устройства вызывать образование микроядер в незрелых полихроматических эритроцитах, обнаруженных в костном мозге взрослых мышей.
Мутагенность Эймса
В тесте на мутагенность Эймса используется несколько штаммов Salmonella typhimurium, отобранных по их чувствительности к мутации из-за:
Тестовые штаммы также нуждаются в гистидине для роста из-за мутации в гене, контролирующем выработку гистидина.
Тесты Эймса выполняются путем смешивания экстракта тестируемого вещества с тестируемым организмом в мягком агаровом растворе, содержащем только небольшое количество гистидина. Гистидин позволяет инокулированному тестируемому организму проникать в ограниченное количество отсеков, но его недостаточно для нормального роста.
Однако, если штамм подвергается обратной мутации (спонтанной или индуцированной тестируемым веществом или материалом положительного контроля), организму больше не требуется гистидин для роста и он может производить видимую колонию или реверсор. Мутации в тестовом организме только в области гена гистидина заставляют тестовый организм обратить мутацию в организм, который больше не требует гистидина.
Подбираются тестовые штаммы для обнаружения различных типов мутагена. Используемые тестовые штаммы - ТА97А, ТА98, ТА100, ТА102 и ТА1535.
Также выполняется точечный тест, при котором экстракты тестируемого продукта окрашиваются на планшете, содержащем небольшое количество гистидин-содержащего тест-организма. По мере того, как тестируемое вещество диффундирует через агар, оно становится более разбавленным. Это позволяет обнаруживать мутагены, которые вызывают некоторое подавление тестируемых штаммов. Испытания проводятся с активацией S-9 или без активации S-9. Система активации S-9 предназначена для моделирования ферментных систем печени млекопитающих и используется для обнаружения веществ, метаболически активируемых из немутагенных форм.
Тест на хромосомную аберрацию выполняется путем воздействия на клетки CHO экстракта тестируемого вещества. Среда для кровотечения включена в анализ в качестве отрицательного контроля.
Клетки СНО высевают во флаконы для клеточных культур площадью 75 см 2 и инкубируют со средой для культивирования клеток + 10% сыворотки до 40-60% слияния.
Клетки CHO подвергаются воздействию экстракта тестируемого продукта в присутствии и в отсутствие системы метаболической активации. Система метаболической активации представляет собой смесь гомогената S9, изоцитрата и НАДФ. В качестве положительного контроля использовали циклофосфамид с метаболической активацией и митомицин С без метаболической активации.
Перед сбором клеток клетки исследуют на цитотоксичность. Флаконы оценивают в соответствии со степенью различимой морфологической цитотоксичности по относительной шкале от 10993 до 5 согласно AAMI / ANSI / ISO 87-0 и USP <4>. Среднее значение результатов для трех бутылок усредняется для получения окончательной оценки цитотоксичности.
В конце периодов воздействия и экспрессии клетки задерживают в метафазе с помощью колтазида. Затем клетки удаляют из флаконов и обрабатывают гипотоническим раствором и фиксатором. Клетки помещают на предметные стекла микроскопа. Хромосомы окрашивают красителем Гимза и покрывают Permount. Затем клетки исследуют под микроскопом на предмет хромосомных аномалий.
Биосовместимость При тестировании генотоксичности клетки лимфомы мышей используются для определения того, способен ли тестируемый материал вызывать точечные мутации или кластогенный (хромосомный разрыв) в культивируемой линии клеток млекопитающих. В этом случае целевой ген, тимидинкиназа (ТК), является распределяемым геном. Потеря активности ТЗ указывает на то, что произошла мутация. Поскольку TK участвует в пути восстановления тимидина, полученного в результате метаболизма ДНК, клетки могут синтезировать тимидин de novo. Следовательно, потеря ТЗ не делает клетку неодушевленной.
Мутанты могут быть отобраны, и частота мутантов может быть определена путем включения аналога тимидина (трифтортимидина или TFT) в культуральную среду клеток после воздействия тестируемого материала. Обычные ячейки с интактными ТЗ включают аналог и шаблон; Мутантные клетки (лишенные активности ТК) выживают, образуют колонии и количественно определяют.
В тесте Mouse Micronucleus медицинское устройство удаляется в полярной и неполярной среде. Положительные и отрицательные контроли экстракта тестируемого продукта вводят в дозе 20 мл / кг как самцам, так и самкам мышей. Костный мозг затем собирают через 24 и 48 часов после введения дозы и исследуют на наличие микроядерных полихроматических эритроцитов (PCE). Наличие PCE указывает на утечку мутагенного вещества из устройства.
EUROLAB, со своей высокопрофессиональной командой и лабораториями, аккредитованными на международном уровне, Генотоксичность полностью и надежно выполняет все услуги по тестированию, анализу, измерению, оценке и созданию отчетов.
Вы можете попросить нас заполнить нашу форму, чтобы записаться на прием, получить более подробную информацию или запросить оценку.
