Für Biokompatibilitätstests, für die Genotoxizitätstests erforderlich sind, bieten wir je nach Produkttyp und Datenanforderungen verschiedene Testtypen an, darunter Ames-Mutagenität, Chromosomenaberration, Mauslymphom und Mausmikronukleus. Diese Tests entsprechen den OECD- und ISO-Richtlinien als eine von drei In-vitro-Teststufen für Genotoxizität.
Der Ames-Mutagenitätstest wird verwendet, um die potenzielle mutagene Aktivität eines Extrakts aus einem medizinischen Gerät / Material zu bestimmen. Der bakterielle Umkehrmutationstest (Ames-Test) wird als Teil der Genotoxizitätsbatterie von Tests durchgeführt, um festzustellen, ob Lecks aus einem medizinischen Gerät / Material mutagen sind.
Der Chromosomenaberrationstest wird verwendet, um medizinische Geräte / Verbrauchsmaterialien zu scannen, um festzustellen, ob sie strukturelle Chromosomenanomalien in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) verursachen. Der Test wird an Geräten / Materialien mit permanentem Patientenkontakt, längerem Patientenkontakt oder Blutkontakt durchgeführt. Der Chromosomenaberrationstest entspricht den OECD- und ISO-Richtlinien als eine von drei Stufen von In-vitro-Tests auf Genotoxizität.
Bei Maus-Lymphom-Tests werden häufig Säugetierzellkulturen verwendet, um Genmutationen, Änderungen der Chromosomenstruktur und -zahl sowie andere durch Medizinprodukte, Material oder Extrakte verursachte Gentoxizitäten zu identifizieren. Diese Tests werden verwendet, um sicherzustellen, dass Geräte, die einen langfristigen Kontakt mit dem Körper haben, keine Genotoxizität aufweisen, die zu Genmutationen mit Krebspotential führen könnte.
Der Maus-Mikronukleus-Assay wird verwendet, um das Potenzial eines medizinischen Geräts zur Induktion der Mikronukleusbildung in unreifen polychromatischen Erythrozyten im Knochenmark erwachsener Mäuse zu bewerten.
Ames Mutagenität
Der Ames-Mutagenitätstest verwendet mehrere Salmonella typhimurium-Stämme, die aufgrund ihrer Mutationsanfälligkeit ausgewählt wurden aufgrund von:
Teststämme benötigen aufgrund einer Mutation im Gen, das die Histidinproduktion steuert, auch Histidin für das Wachstum.
Ames-Tests werden durchgeführt, indem ein Extrakt der Testsubstanz mit dem Testorganismus in einer Weichagarlösung gemischt wird, die nur eine geringe Menge Histidin enthält. Histidin ermöglicht es dem inokulierten Testorganismus, in eine begrenzte Anzahl von Kompartimenten einzudringen, reicht jedoch nicht aus, um ein normales Wachstum zu ermöglichen.
Wenn der Stamm jedoch einer umgekehrten Mutation unterzogen wird (spontan oder durch die Testsubstanz oder ein positives Kontrollmaterial induziert), benötigt der Organismus kein Histidin mehr zum Wachstum und kann eine sichtbare Kolonie oder einen Umkehrer produzieren. Mutationen zum Testorganismus nur in der Histidin-Genregion bewirken, dass der Testorganismus die Mutation in einen Organismus umkehrt, der kein Histidin mehr benötigt.
Teststämme werden ausgewählt, um verschiedene Arten von Mutagen nachzuweisen. Die verwendeten Teststämme sind TA97A, TA98, TA100, TA102 und TA1535.
Es wird auch ein Spot-Test durchgeführt, bei dem Extrakte des Testprodukts auf einer Platte gefärbt werden, die eine kleine Menge Histidin-haltigen Testorganismus enthält. Wenn die Testsubstanz durch den Agar diffundiert, wird sie stärker verdünnt. Dies ermöglicht den Nachweis von Mutagenen, die eine gewisse Hemmung der Teststämme verursachen. Tests werden mit S-9-Aktivierung oder ohne S-9-Aktivierung durchgeführt. Das S-9-Aktivierungssystem wurde entwickelt, um Leberenzymsysteme von Säugetieren zu simulieren, und wird zum Nachweis von Substanzen verwendet, die eine metabolische Aktivierung aus nicht mutagenen Formen erfahren.
Der Chromosomenaberrationstest wird durchgeführt, indem die CHO-Zellen dem Testsubstanzextrakt ausgesetzt werden. Ein Blutungsmedium wird als Negativkontrolle in den Assay aufgenommen.
CHO-Zellen werden in 75 cm²-Zellkulturkolben ausgesät und mit Zellkulturmedium + 2% Serum bis zu einer Konfluenz von 10-40% inkubiert.
CHO-Zellen werden in Gegenwart und Abwesenheit eines metabolischen Aktivierungssystems Testproduktextrakt ausgesetzt. Das metabolische Aktivierungssystem ist eine Mischung aus S9-Homogenat, Isocitrat und NADP. Als positive Kontrollen werden Cyclophosphamid mit metabolischer Aktivierung und Mitomycin C ohne metabolische Aktivierung verwendet.
Vor der Zellernte werden die Zellen auf Zytotoxizität untersucht. Die Fläschchen werden nach dem Grad der unterscheidbaren morphologischen Zytotoxizität auf einer relativen Skala von 10993 bis 5 gemäß AAMI / ANSI / ISO 87-0 und USP 4 bewertet. Der Durchschnitt der Ergebnisse aus den drei Flaschen wird gemittelt, um einen endgültigen Zytotoxizitätswert zu erhalten.
Am Ende der Expositions- und Expressionsperioden werden die Zellen an der Metaphase mit Coltazid angehalten. Die Zellen werden dann aus den Fläschchen entfernt und mit einer hypotonischen Lösung und einem Fixiermittel behandelt. Zellen werden auf Objektträgern abgelagert. Die Chromosomen werden mit Giemsa-Färbung angefärbt und mit Permount bedeckt. Die Zellen werden dann mikroskopisch auf Chromosomenanomalien untersucht.
Biokompatibilität Bei Genotoxizitätstests werden Maus-Lymphomzellen verwendet, um zu bestimmen, ob ein Testmaterial in der Lage ist, Punktmutationen oder klastogene (Chromosomenbrüche) in einer kultivierten Säugetierzelllinie zu induzieren. In diesem Fall ist das Zielgen, die Thymidinkinase (TK), ein entbehrliches Gen. Ein Verlust der TK-Aktivität zeigt an, dass eine Mutation aufgetreten ist. Da TK an einem Rettungsweg für Thymidin beteiligt ist, der aus dem DNA-Metabolismus stammt, können Zellen Thymidin de novo synthetisieren. Daher macht der Verlust von TK die Zelle nicht unbelebt.
Mutanten können ausgewählt und Mutantenfrequenzen abgeleitet werden, indem das Thymidinanalogon (Trifluorothymidin oder TFT) nach Exposition gegenüber dem Testmaterial in das Kulturmedium von Zellen eingebaut wird. Normale Zellen mit intakter TK umfassen Analogon und Matrize; Mutante Zellen (ohne TK-Aktivität) überleben, bilden Kolonien und quantifizieren.
Beim Maus-Mikronukleus-Test wird ein medizinisches Gerät in einer polaren und unpolaren Umgebung entfernt. Positive Kontrollen und negative Kontrollen des Testproduktextrakts werden sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen mit 20 ml / kg verabreicht. Das Knochenmark wird dann 24 und 48 Stunden nach der Dosierung geerntet und auf das Vorhandensein von mikronuklearen polychromatischen Erythrozyten (PCEs) untersucht. Das Vorhandensein von PCEs ist ein Hinweis auf die aus dem Gerät austretende mutagene Substanz.
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