AOAC 991.43 Fibra dietética total, soluble e insoluble en alimentos - Método enzimático-gravimétrico MES-TRIS Bufler A

Según la norma “AOAC 991.43 Fibra dietética total, soluble e insoluble en alimentos - Método enzimático-gravimétrico MES-TRIS Bufler A”, desarrollada por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC), dos muestras de alimentos secos (desgrasados ​​si contienen más del 10 % de grasa) se someten a digestión enzimática secuencial con α-amilasa termorresistente, proteasa y amiloglucosidasa para eliminar el almidón y las proteínas. Para la fibra dietética total, el producto de la digestión enzimática se trata con alcohol para precipitar la fibra dietética soluble antes de la filtración, y el residuo de fibra dietética total se lava con alcohol y acetona, se seca y se pesa. Para la fibra dietética insoluble y soluble, el producto de la digestión enzimática se filtra, y la fibra dietética insoluble residual se lava con agua tibia, se seca y se pesa. Para la fibra dietética soluble, el filtro y el residuo combinados se precipitan con alcohol, se filtran, se secan y se pesan. Los valores residuales de fibra dietética total, insoluble y soluble se corrigen en función de las proteínas, las cenizas y el espacio vacío.

En las pruebas se utilizan los siguientes equipos:

• Vasos de precipitados: de 400 o 600 ml (en cualquier formato).
• Crisol de filtración: Disco sinterizado, de grano grueso, tamaño de poro ASTM 40-60 Hm, Pyrex de 60 mL. Se prepara de la siguiente manera: Se incinera durante la noche en un horno de cenizas a 525 grados. Antes de retirar los crisoles, se deja que la temperatura del horno descienda por debajo de 130 grados. A continuación, los crisoles se dejan en remojo en una solución de limpieza al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora.

Los crisoles se enjuagan con agua corriente y luego con agua desionizada. Se utilizan 15 ml de acetona para el enjuague final y, a continuación, se secan al aire. Se añade aproximadamente 1,0 g de Celite a los crisoles secos y se secan a 130 °C hasta alcanzar un peso constante. El crisol se enfría en un desecante durante aproximadamente 1 hora y se registra el peso del crisol con la Celite con una precisión de 0,1 mg.

• Sistema de vacío: Bomba de vacío o aspirador con dispositivo regulador. Botella filtrante de 1 L de paredes gruesas con brazos laterales. Adaptadores de anillo de goma para su uso con filtración. Mascarillas.
• Baños de agua con agitación: Con un temporizador automático de encendido/apagado, puede mantener una temperatura de 98 grados con una tolerancia de ±2 grados. Se puede ajustar una temperatura constante de 60 grados.
• Balanza: Analítica, precisión de más/menos 0,1 mg.
• Horno de mufla: Puede mantener una temperatura de 525 grados más/menos 5 grados.
• Horno: Puede mantener temperaturas entre 105 y 130 grados Celsius con una tolerancia de más/menos 3 grados.
• Desecante: Dióxido de silicio o desecante equivalente. Cada dos semanas, el desecante se seca durante la noche a 130 grados.
• Medidor de pH: Compensado en temperatura, valores de pH estandarizados con soluciones tampón de 4, 0, 7, 0 y 10, 0.
• Pipetas: Con puntas desechables. Capacidad de 100-300 µL y 5 mL.
• Distribuidores.
• Agitadores magnéticos y varillas de agitación.

La norma AOAC 991.43 es uno de los métodos formales más reconocidos e históricamente significativos para determinar la fibra dietética en los alimentos. Desde su publicación inicial en 1991, este método ha sido fundamental para el análisis de la fibra dietética. Antes de esta norma, la fibra dietética generalmente se medía solo como fibra cruda. El método descrito en la norma AOAC 920.86 subestimaba considerablemente el contenido real de fibra dietética, ya que solo capturaba una pequeña fracción de celulosa y lignina, mientras que la mayor parte de la hemicelulosa, la pectina, la goma y el almidón resistente se perdía.

La norma AOAC 991.43 se desarrolló para proporcionar una medición fisiológicamente más precisa que refleje mejor lo que realmente resiste la digestión en el intestino delgado humano (la definición fisiológica de fibra dietética), y se ha convertido en la base de los valores de fibra dietética en millones de etiquetas nutricionales en todo el mundo.

Este método utiliza una combinación de digestión enzimática y determinación gravimétrica:

• Preparación de la muestra: Las muestras de prueba dobles se gelatinizan con α-amilasa termorresistente.
• Digestión enzimática: Las enzimas proteasa (para eliminar proteínas) y amiloglucosa (para hidrolizar el almidón digerible en glucosa) simulan las condiciones digestivas humanas (pH, temperatura y duración similares a las de la boca, el estómago y el intestino delgado).
• Precipitación de la fibra dietética: Se añade etanol (4 volúmenes) para precipitar los polímeros solubles de la fibra dietética y eliminar las sustancias digeridas.
• Filtrado y lavado: El residuo (que contiene la fibra dietética total) se filtra, se lava con etanol y acetona, se seca y se pesa.
• Corrección de proteínas y cenizas: Se analiza un par de muestras para determinar la proteína residual y el otro para las cenizas; estos valores se restan para obtener la fibra dietética total corregida.
• Separación opcional de fibras solubles e insolubles: Antes de la precipitación con etanol, el producto digestivo puede filtrarse. El residuo que queda tras la filtración es la fibra dietética insoluble. El filtrado se precipita con etanol para recuperar la fibra dietética soluble. Fibra dietética total = Fibra dietética insoluble + fibra dietética soluble.

Las características básicas de este método son las siguientes:

• Mide tanto la fibra dietética soluble como la insoluble.
• Contiene almidón resistente, que es resistente a la digestión enzimática.
• El DP contiene la mayoría de los oligosacáridos indigeribles, siendo los 10 primeros los que presentan la menor concentración (debido a que precipitan en etanol al 78%).
• DP excluye los oligosacáridos indigeribles 3-9, que requieren métodos separados.

Las ventajas de este método son las siguientes:

• Equipo relativamente sencillo (no requiere HPLC).
• Resultados sólidos y reproducibles en diferentes laboratorios.
• Datos de validación exhaustivos y estudios interlaboratorio.
• Mide las fibras fisiológicamente relevantes.

Uso práctico actual:

• Todavía se utiliza como método de referencia en muchos países que no han adoptado la nueva definición del Codex/FDA.
• Se utiliza con frecuencia en la investigación al comparar datos históricos.
• Muchos laboratorios prefieren los métodos nuevos, donde las diferencias son mínimas, para el análisis de productos de cereales, verduras y alimentos tradicionales ricos en fibra.

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